仙鶴草配方顆粒中槲皮素含量測定及指紋圖譜研究*

俞 杰，侯 靜，許豪杰，黃 琪，聞佳濤

（浙江佐力藥業股份有限公司研發中心，浙江 湖州 313200）

仙鶴草Agrimonia pilosaLedeb L.始載于北宋蘇頌《圖經本草》，為薔薇科多年生草本植物龍芽草的全草，主產于浙江、江蘇等地［1-3］，含有黃酮類、三萜類、酚類、酯類、鞣質類等有效成分，具有收斂止血、解毒殺蟲、補虛益氣強心等功效［4-5］。現代藥理學研究表明，仙鶴草有抗腫瘤作用［6］。仙鶴草中的抗氧化成分主要有黃酮類、多酚類和鞣質［7］，黃酮類物質有降血糖作用［8］。對仙鶴草中黃酮類成分的研究發現，其主要含槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素及糖苷［8-9］。目前，《中國藥典》中暫未規定仙鶴草質量控制的指標性成分。為此，本研究中對仙鶴草標準湯劑中槲皮素含量及指紋圖譜進行研究，為該顆粒制劑質量標準的建立提供參考?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Mettler SX205 型電子分析天平（瑞士Mettler 公司，精度為十萬分之一）；FA2004B 型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司，精度為萬分之一）；LS220A 型電子分析天平（德國Sartorius 公司，精度為千分之一）；KQ-500VDB型超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）。

1.2 試藥

槲皮素對照品（批號為100081-201610，含量99.1%），仙鶴草對照藥材（批號為121464-201303），均購自中國食品藥品檢定研究院；仙鶴草配方顆粒（浙江佐力藥業股份有限公司、批號為19080162，浙江貝尼菲特股份有限公司、批號為1908024，浙江景岳堂股份有限公司、批號為YK2003006，依次記為P1，P2，P3）；乙腈為色譜純，甲醇、磷酸均為分析純，水為純化水。共收集仙鶴草藥材16批（記為S1-S16，批號及產地見表1）。

表1 仙鶴草藥材的批號與產地Tab.1 Batch numbers and origin of Agrimonia pilosa

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：DIKMA Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸水溶液（28∶72，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：368 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.1.2 樣品及溶液制備

標準湯劑：稱取藥材飲片樣品100 g，置煎藥鍋中，加水煎煮2 次，第一次加飲片量8 倍的水，攪拌，浸潤，浸泡30 min，大火加熱至微沸，轉小火煮沸30 min，藥液用100目不銹鋼篩濾過；第2次加飲片量6倍的水，大火加熱至微沸，轉小火煎煮20 min，藥液用100 目不銹鋼篩濾過，合并2次的濾液，置旋轉蒸發器，50～60 ℃減壓濃縮至體積約為1∶1 的浸膏，冷凍干燥，即得飲片標準浸膏（湯劑）。

相關溶液：取槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇定容，制成質量濃度為11.60 μg/mL 的對照品溶液。取標準浸膏樣品和配方顆粒樣品各約1.0 g，精密稱定，加甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）50 mL，稱定質量，加熱回流30 min，取出，放冷至室溫，再次稱定質量，用甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按樣品處方工藝取輔料，制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

專屬性試驗：取配方顆粒供試品溶液（批號為19080162）、對照品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應吸收峰，陰性對照無干擾，專屬性良好。詳見圖1。

線性關系考察：量取2.1.2項下對照品溶液2，4，6，8，10，20 μL，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以槲皮素質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得槲皮素回歸方程Y=56.191X-7.615 9（R2=1.000 0，n=6）。結果表明，槲皮素質量濃度在2.32～23.19 μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取2.1.2 項下對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果的RSD小于2.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.1.2 項下配方顆粒供試品溶液，室溫下放置0，2，4，8，12，18，24，36 h 時，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD小于2.0%（n=8），表明室溫下供試品溶液放置36 h內穩定。

重復性試驗：取2.1.2 項下配方顆粒供試品溶液6 份，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD小于2.0%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取配方顆粒樣品（批號為19080162），研細，取約0.5 g，共6 份，精密稱定，精密加入槲皮素對照品溶液50 mL，混勻，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.1.4 耐用性試驗

考察不同色譜柱、柱溫、流動相比例及流速對本色譜條件的耐用性，結果見表3?？梢?，各色譜條件發生一定程度變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。

表3 耐用性試驗結果Tab 1 Results of the durability test

2.1.5 樣品含量測定

取16 批標準湯劑樣品及3 批配方顆粒樣品，依法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算樣品含量。結果見表4。

表4 樣品中槲皮素含量測定結果（mg/g，n=2）Tab.2 Results of content determination of quercetin in the samples（mg/g，n=2）

2.2 指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：DIKMA Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗 脫（0～20 min 時0%A →20%A，20～30 min 時20%A，30～40 min 時20%A →30%A，40～50 min 時30%A →40%A，50～60 min 時40%A →50%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：250 nm；柱溫：30 ℃。結果各峰分離度和峰形均較好。

2.2.2 參照物選擇及相關成分確認

標準湯劑化學成分多為黃酮類（主要有槲皮素和蘆丁等），考慮到多成分、整體質量控制，以仙鶴草對照藥材作對照，為保持對照藥材與標準湯劑工藝基本一致，將對照藥材以水超聲提取，取對照藥材約2 g，加水25 mL，加水煎煮30 min，放冷，濾過，蒸干，加入甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，取出，放冷至室溫，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。結果對照藥材與配方顆粒樣品色譜圖基本一致。

2.2.3 對照指紋圖譜建立

按國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，對16批標準湯劑的HPLC 圖的色譜峰進行自動匹配，形成共有峰，建立對照指紋圖譜。結果見圖2。16 批標準湯劑樣品的指紋圖譜無明顯差異，共有5 個共有峰，相對保留時間的RSD為0.00%～1.09%，表明不同產地的飲片制成的標準湯劑具有類似的化學成分，5 個共有峰的相對峰面積的RSD無明顯差異，表明不同產地標準湯劑中化學成分含量無明顯差異。

2.2.4 相似度計算

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件系統（2012版）”，以共有峰計算16批樣品與對照指紋圖譜的相似度，結果整體相似度為0.985～1.000，表明標準湯劑一致性良好。詳見表5。

表5 16批標準湯劑指紋圖譜相似度Tab.5 Similarity of fingerprints of 16 batches of standard decoction

2.2.5 共有峰標定

將標準湯劑HPLC 指紋圖譜數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”，選擇時間寬度為0.1，中位數法生成對照指紋圖譜，通過分析共確定5個共有峰。與仙鶴草對照品色譜圖進行對比，確認標準湯劑HPLC 指紋圖譜中5（S）峰為槲皮素。詳見圖3。

2.2.6 配方顆粒檢測

取3 批配方顆粒樣品（批號依次為19080162，1908024，YK2003006），按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，圖譜見圖4。各共有峰相對保留時間和標準湯劑對照特征圖譜基本一致，重復性較好，4 批樣品與對照指紋圖譜的相似度均大于0.9。表明建立的特征圖譜可用于配方顆粒的質量分析。

3 討論

中藥配方顆粒以傳統中醫藥理論為指導，以臨床應用為基礎，按現代標準化工藝將中藥飲片制成顆粒劑，可保障用藥準確性和劑量的一致性［10］。2016年，國家藥典委員會《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》（征求意見稿）中提出，將標準湯劑作為中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的標準參照物，用中藥飲片標準湯劑作為標準體系，有利于保障臨床療效的一致性，可為中藥配方顆粒制備工藝的標準化和產品質量的一致性提供參照［11-14］。中藥的成分復雜多樣，指紋圖譜或特征圖譜等可對多組分進行分析，可更好地用于中藥質量的整體性評價［15］。

本研究中基于傳統煎藥工藝，運用現代實驗室方法制備仙鶴草飲片標準湯劑，以3批仙鶴草配方顆粒對其進行質量標準研究。飲片產地包含浙江舟山、河南信陽、江蘇蘇州3 個產地，涵蓋了仙鶴草的道地產地和主產區，具有較好的代表性。由于槲皮素在仙鶴草中具有抗氧化作用和降血糖作用［11-12］，藥理作用明確，故以槲皮素作為仙鶴草配方顆粒含量測定的指標性成分。

本研究中考察了乙腈-0.2%磷酸水溶液不同比例流動相，發現以28∶72（V/V）為宜，各峰分離度和峰形均較好，保留時間適中，故使用該方法作為流動相。由于中藥所含黃酮、蒽醌等活性成分多數有紫外吸收，適用于光電二極管陣列檢測器檢測［16］。本研究中在200～400 nm 波長范圍內對供試品溶液進行掃描，通過等吸收圖譜進行分析，發現波長為250 nm 時效果最好，故以其作為檢測波長。方法學考察中，儀器精密度、重復性、穩定性、耐用性和中間精密度的RSD均小于3%，表明該方法準確、可行、重復性良好，可用于仙鶴草配方顆粒的質量控制。標準湯劑中槲皮素含量為2.88 mg/g，且不同產地樣品含量無明顯差異，但不同批次間槲皮素含量存在一定差異，可能受采收時間和貯藏方式的影響。配方顆粒中的槲皮素含量均低于標準湯劑中的含量，考慮受原藥材質量差異及制備工藝等因素的影響。后續可進一步探更多指標性成分及其在原藥材、標準湯劑、配方顆粒中的量及轉移情況。且還需從配方顆粒與標準湯劑及傳統湯劑的關聯性、差異性等方面，并結合藥效物質基礎、藥理活性等多方面進行研究，為中藥配方顆粒質量控制體系的建立提供依據。