新生期小鼠多次氯胺酮麻醉對遠期認知功能的影響及其機制研究*

殷藝娜，馬敏，常俊曉，孔玉芳，芮琳琳，褚國強

（1.南京醫科大學附屬常州婦幼保健院 麻醉科，江蘇 常州213003；2.南通大學附屬醫院麻醉科，江蘇 南通226001；3.南京醫科大學附屬常州婦幼保健院 保健科，江蘇 常州213003）

氯胺酮作為N-甲基-D-天冬氨酸受體的非競爭性拮抗劑，因其獨特的麻醉特性，被廣泛應用于產科和小兒外科的手術麻醉[1]。嬰幼兒神經系統發育期是神經系統最脆弱、最容易受到損害的時期，全身麻醉藥物是否影響患兒的大腦發育及學習記憶功能一直是臨床及科研工作者關注的熱點[2]。以往對于氯胺酮致發育期神經毒性的研究主要集中在神經元凋亡、神經炎癥等方面[3]，對小膠質細胞在其中發揮的作用研究較少。因此，本研究旨在進一步探究氯胺酮致發育期神經毒性作用機制是否與小膠質細胞發育及功能改變有關，以期為氯胺酮致發育期神經毒性作用機制研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年昆明小鼠置于室溫（25±1）℃、濕度20%～30%的動物房中分籠飼養，12 h 晝/夜循環照明，自由攝食、攝水。適應性飼養1周，每天下午4:00～6:00 按照雌雄比例2∶1～3∶1 合籠交配，使母鼠受孕，合籠后第2～6 天上午檢查陰道栓子有無脫落。母鼠受孕后陰道口可見乳白色陰道栓，此時記為孕0.5（E0.5）。孕鼠自然分娩即新生小鼠出生當日記為P0，新生小鼠斷奶前（出生后21～24 d）母鼠喂養，斷奶后普通飼料喂養。實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2017-0007，實驗動物使用許可證號SYXK（蘇）2017-0044。本動物實驗經南京醫科大學實驗動物倫理委員會審批通過。

1.2 實驗分組

將出生后6 d（P6）的同窩昆明小鼠按隨機數字表法分為對照組和氯胺酮組，每組36只。兩組采用腹腔注射給藥方式，氯胺酮單次給藥劑量為80 mg/kg，對照組每次注射與氯胺酮組等體積的生理鹽水。兩組每天下午2:00 注射1 次，連續注射5 d。兩組動物每次注射完畢后，分別放入單獨鼠籠中，各項操作輕柔，密切注意小鼠皮膚顏色變化，防止發生低氧血癥，待小鼠翻正反射恢復后放回原來的鼠籠。

1.3 主要試劑與儀器

鹽酸氯胺酮注射液（福建古田藥業有限公司），0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司），羊Iba1多克隆抗體（美國Abcam 公司），Alexa Flour 546 驢抗山羊IgG（美國Invitrogen 公司），兔CX3CR1 單克隆抗體（美國Abcam 公司），鼠β-actin 多克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）。Morris 水迷宮（上海吉量軟件科技公司），ChemiDocTM XRS + 凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司），冷凍切片機（德國Leica 公司），顯微照相系統（日本Olympus公司）。

1.4 方法

1.4.1 水迷宮測試 兩組小鼠給藥1 個月和2 個月后分別取20 只行Morris 水迷宮實驗。實驗在直徑100 cm、水深40 cm 的圓形水池中進行，水溫維持在（20±1）℃。將直徑6 cm 的圓形平臺放入目標象限，并隱匿于水面下1 cm 處。實驗前1 d，將小鼠放入迷宮水池中自由游行1 min，使其適應水池及周圍環境。前期訓練共持續5 d，自第1 天起，每天下午2:00 開始訓練，將小鼠頭朝向水池壁，從第一象限開始，依次從4 個象限的入水點放入水中，記錄小鼠入水至爬上平臺所需時間，即逃避潛伏期；若小鼠60 s 未爬上平臺統一按照60 s 計算，并由實驗者將其引導上平臺并停留15 s，反映被測小鼠的學習能力。第6 天進行定向航行實驗，將小鼠于平臺對側象限入水點放入水中，記錄小鼠入水到爬上平臺所需時間；若小鼠60 s 內未爬上平臺則統一按照60 s 計算。然后撤去平臺，將小鼠于平臺對側象限入水點放入水中，記錄小鼠在60 s內搜索平臺的路線圖、目的象限停留時間及穿臺次數，反映小鼠學會尋找平臺后，對平臺的空間位置記憶能力。

1.4.2 免疫熒光染色 選取P11、P16、P21、P35、P67 小鼠各8 只，腹腔注射水合氯醛350 mg/kg 麻醉，固定四肢，開胸暴露心臟，由左心室心尖部插入頭皮針至升主動脈，剪開右心耳，快速灌注肝素、生理鹽水，直至肝臟變白，右心耳流出的液體透明，再以4%多聚甲醛灌注，直至下肢、鼠尾變硬，隨即斷頭、取腦。將全部腦組織置于4℃、4%多聚甲醛固定24 h 后取出，置于30%蔗糖脫水，直至組織沉底。用濾紙吸干腦組織表面水分，放入包埋劑內，置于-20℃冷凍切片機中速凍60 min，調整切片厚度為40 μm，采取冠狀位連續切片，以海馬前聯合為標記點，采用Iba1 對小鼠海馬齒狀回小膠質細胞進行標記。順序選取其后第6～15 張含海馬區切片，置于0.01 mol/L PBS 液內備用。將腦組織切片用0.01 mol/L PBS 搖床洗滌3 次，5 min/次；3%BSA 常溫封閉1 h。一抗孵育：羊源DCX（1∶200，0.4 % PBST 稀釋）4℃搖床孵育24 h；0.01 mol/L PBS搖床洗滌3 次，5 min/次；二抗孵育：Alexa Flour 546 標記的驢抗山羊IgG（1∶200，0.4%PBST 稀釋）室溫避光孵育2 h；0.01 mol/L PBS 搖床洗滌3 次，5 min/次，進行貼片并晾干切片，全程避光；每張載玻片上均勻滴入DAPI 染液100 μl，染色10 min后PBS 沖洗并晾干，全程避光；防淬滅封片劑封片，置于FV1000 激光共聚焦顯微鏡下，用Olympus Fluoview Ver.4.2a 軟件觀察和拍片，在Image-Pro Plus 軟件下手動計數細胞，計算每個20 倍物鏡視野下（620 μm×620 μm）海馬齒狀回區域Iba1 陽性細胞數，并計算每平方毫米Iba1 陽性細胞數。計數過程中采用盲法，圖像分析軟件的分析參數一致。

1.4.3 Western blotting檢測CX3CR1蛋白 小膠質細胞發育、成熟過程中受許多因素影響，CX3CR1是小膠質細胞發育、成熟過程中的“特征”因子[4-5]。選取P11、P16、P21、P35、P67 小鼠各8只，直接斷頭后置于冰上取腦，迅速分離出雙側海馬組織，分別取RIPA 蛋白裂解液和100 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑，按照100∶1 比例混合。稱取組織重量，按照每100 mg 組織加入100 μl 蛋白裂解液的比例加入適量裂解液，在冰上進行組織勻漿。4℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液。BCA 法測定樣本蛋白濃度后，各組用裂解液配平。加入5×上樣緩沖液，沸水變性5 min。各組取等量樣本蛋白在12% SDS-PAGE 凝膠系統上樣，先恒壓80 V至溴酚藍跑到濃縮膠與分離膠分界處，再恒壓120 V使溴酚藍跑至底部。跑完電泳后，進行半干轉，轉膜結束后，搖床上溫和振蕩，3% BSA 常溫封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜。復溫后Washing Buffer 洗滌3 次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標記二抗，搖床上溫和振蕩，常溫孵育2 h。Washing Buffer 洗滌3 次，5 min/次。膜上滴適量ECL 發光液，將膜放入凝膠成像儀，采用化學發光法檢測并采集圖像。用Image J 圖像分析軟件對所得條帶進行光密度掃描，各組CX3CR1 蛋白條帶光密度值與內參蛋白光密度值的比值為CX3CR1 蛋白相對表達量。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 16.0 和Graph Pad Prism 6 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗或重復測量設計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組學齡期小鼠水迷宮行為學變化

氯胺酮組與對照組學齡期小鼠訓練前第1 天、第2 天、第3 天、第4 天、第5 天逃避潛伏期比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點學齡期小鼠逃避潛伏期有差異（F=34.213，P=0.000）。②氯胺酮組與對照組學齡期小鼠逃避潛伏期有差異（F=19.856，P=0.000）；氯胺酮組與對照組相比逃避潛伏期較長（P<0.05），多次氯胺酮麻醉可能導致學齡期小鼠學習記憶功能障礙。③兩組學齡期小鼠逃避潛伏期變化趨勢有差異（F=12.436，P=0.000）。見表1。

表1 兩組學齡期小鼠不同時間點的逃避潛伏期變化（n=20，s，±s）

組別對照組氯胺酮組t 值P 值第1天41.7±7.8 43.9±5.4 1.037 0.304第2天33.4±10.3 39.9±7.7 2.260 0.030第3天29.5±8.8 38.2±7.4 3.384 0.002第4天24.5±8.8 33.2±7.4 3.384 0.002第5天20.7±7.4 30.7±10.1 3.572 0.001

在第6 天的空間探索實驗中，氯胺酮組與對照組學齡期小鼠60 s 內穿臺次數、目的象限活動時間占比比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P<0.05），對照組高于氯胺酮組。見表2。

表2 兩組學齡期小鼠60 s內穿臺次數和目的象限活動時間比較 （n=20，±s）

表2 兩組學齡期小鼠60 s內穿臺次數和目的象限活動時間比較 （n=20，±s）

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2.2 兩組成年小鼠水迷宮行為學變化

氯胺酮組與對照組成年小鼠訓練前第1 天、第2 天、第3 天、第4 天、第5 天逃避潛伏期比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點成年小鼠逃避潛伏期有差異（F=41.527，P=0.000）。②氯胺酮組與對照組成年小鼠逃避潛伏期有差異（F=21.365，P=0.000）；氯胺酮組與對照組相比逃避潛伏期較長（P<0.05），多次氯胺酮麻醉可能導致學習記憶功能障礙。③兩組成年小鼠逃避潛伏期變化趨勢有差異（F=17.548，P=0.000）。見表3。

表3 兩組成年小鼠不同時間點的逃避潛伏期變化 （n=20，s，±s）

表3 兩組成年小鼠不同時間點的逃避潛伏期變化 （n=20，s，±s）

組別對照組氯胺酮組t 值P 值第1天43.1±7.1 45.2±9.3 0.803 0.440第2天34.6±10.1 38.9±10.1 1.346 0.190第3天26.5±10.0 34.4±6.9 2.908 0.006第4天24.8±6.4 33.4±9.1 3.457 0.001第5天18.6±7.0 30.4±12.5 3.683 0.001

在第6 天的空間探索實驗中，氯胺酮組與對照組成年小鼠60 s 內穿臺次數、目的象限活動時間占比比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P<0.05），對照組高于氯胺酮組。見表4。

表4 兩組成年小鼠60 s內穿臺次數和目的象限活動時間占比比較 （n=20，±s）

表4 兩組成年小鼠60 s內穿臺次數和目的象限活動時間占比比較 （n=20，±s）

組別對照組氯胺酮組t值P值穿臺次數2.7±1.3 1.7±1.1 2.626 0.011目的象限活動時間占比/%27.2±11.1 21.3±6.7 2.035 0.049

2.3 兩組小鼠海馬齒狀回小膠質細胞數變化

氯胺酮組與對照組P11、P16、P21、P35、P67小鼠海馬齒狀回小膠質細胞數比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P<0.05），對照組均多于氯胺酮組。見表5 和圖1。

圖1 兩組不同階段小鼠海馬齒狀回小膠質細胞 （免疫熒光染色×20）

表5 兩組不同階段小鼠海馬齒狀回小膠質細胞數比較 （n=8，個/mm2，±s）

表5 兩組不同階段小鼠海馬齒狀回小膠質細胞數比較 （n=8，個/mm2，±s）

組別對照組氯胺酮組t 值P 值P11 255.8±17.2 237.2±17.1 3.068 0.004 P16 277.3±15.5 256.6±18.9 3.387 0.002 P21 236.1±21.2 210.9±22.6 3.353 0.003 P35 205.5±12.5 194.5±15.3 2.227 0.033 P67 199.1±14.0 185.9±15.1 2.564 0.016

2.4 兩組小鼠雙側海馬組織CX3CR1蛋白相對表達量變化

氯胺酮組與對照組P11、P16、P21、P35、P67小鼠雙側海馬組織CX3CR1 蛋白相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P<0.05），對照組高于氯胺酮組。見表6 和圖2。

圖2 兩組不同階段小鼠雙側海馬組織CX3CR1蛋白相對表達量變化 （n=8，±s）

表6 兩組不同階段小鼠雙側海馬組織CX3CR1蛋白相對表達量比較 （n=8，±s）

表6 兩組不同階段小鼠雙側海馬組織CX3CR1蛋白相對表達量比較 （n=8，±s）

組別對照組氯胺酮組t 值P 值P11 0.75±0.17 0.55±0.17 2.353 0.033 P16 1.05±0.11 0.85±0.12 3.475 0.004 P21 0.83±0.14 0.64±0.10 3.124 0.007 P35 0.94±0.16 0.73±0.21 2.250 0.038 P67 0.70±0.12 0.53±0.16 2.404 0.029

3 討論

嬰幼兒階段是神經系統發育的高峰期和敏感期，與成人相比更易受到麻醉藥物的損害[6]。嚙齒類動物與靈長類動物的研究表明，氯胺酮的大劑量使用或者持續暴露可以誘導發育期大腦神經細胞變性和凋亡，導致認知功能障礙[7-8]。因此，有人認為氯胺酮只有在作用時間足夠長，濃度足夠大時才會引起神經元結構和認知功能損害[7]。

有研究顯示，小鼠氯胺酮產生麻醉狀態的半數有效量是80 mg/kg[9-10]，據此筆者進行了預實驗，最終確定氯胺酮腹腔注射麻醉劑量為80 mg/kg。嬰幼兒神經系統發育期是神經系統最脆弱、最容易受到損害的時期，故本研究中氯胺酮的給藥時段設在大腦發育高峰期及小膠質細胞增殖、發育高峰時期，約出生后2 周左右[11]。前期預實驗選擇出生后6 d 小鼠腹腔注射氯胺酮80 mg/（kg·d）或同等體積生理鹽水，并分設連續給藥1 次、3 次和5 次實驗組，以確定腹腔注射氯胺酮80 mg/（kg·d）劑量下，給藥次數對小鼠遠期認知功能的影響。選取出生后6 d 小鼠1 次或連續3 次給藥，1 個月后Morris 水迷宮實驗檢測兩組小鼠逃避潛伏期、穿臺次數、目的象限活動時間占比等無差異，說明新生期小鼠氯胺酮1 次或連續3 次暴露不足以造成長期空間學習記憶功能改變。由此本研究最終確定采用新生期小鼠連續5 次氯胺酮麻醉這一實驗劑量。

小膠質細胞是中樞神經系統中重要的免疫效應細胞，對于維持大腦內環境穩定發揮了不可替代的作用[12]，如參與調節神經系統發育、促進神經環路形成、影響神經元活動、清除病原體及吞噬凋亡的神經元[13]等。關于全身麻醉藥物對小膠質細胞數量、形態及功能的影響目前還沒有明確結論。有研究顯示，中樞神經系統損傷后，腦組織內炎癥因子明顯增加，小膠質細胞持續活化，促使小膠質細胞吞噬增加，加快了突觸退化和過度萎縮，導致小鼠認知障礙[14]。有趣的是，景勝等[15]的研究表明，出生后7 d 小鼠腹腔注射丙泊酚后海馬齒狀回小膠質細胞數減少并且抑制了小膠質細胞活化，這與SHEN 等[16]的結果相反。筆者猜測這些研究結果相反可能與藥物、劑量、實驗模型不同有關。本研究結果顯示，新生期小鼠5 次氯胺酮麻醉后，P11、P16、P21、P35、P67 小鼠海馬齒狀回Iba1 陽性標記的小膠質細胞數明顯減少，推測氯胺酮神經毒性可能抑制了小膠質細胞增殖。

CX3CR1 是趨化因子CX3CL1 的受體，在腦內的特異性由小膠質細胞表達[4-5]。CX3CR1 不僅影響發育期小膠質細胞的分化成熟，對小膠質細胞的形態及功能的維持也具有重要作用[17]。此外，CX3CL1/CX3CR1 也是神經元與小膠質細胞之間重要的信號傳導通路，參與調節機體許多生理過程，包括維持神經元存活、突觸連接的成熟、突觸傳遞及可塑性調節等[18-19]。有研究表明，成年小鼠敲除CX3CR1基因后，海馬區小膠質細胞數量減少，突觸修剪被推遲，這種突觸修剪作用的缺陷會造成樹突棘增多，認知功能受損，提示小膠質細胞減少可能通過CX3CL1/CX3CR1 信號通路導致突觸發育異常及認知功能障礙[20]。本研究發現，P6 小鼠多次氯胺酮麻醉后海馬齒狀回區域Iba1 標記的小膠質細胞數減少，且海馬區CX3CR1 蛋白相對表達量減少。筆者推測小膠質細胞發育抑制，導致CX3CR1 蛋白相對表達量減少，相關信號通路異常，最終影響認知功能。

綜上所述，新生期小鼠多次氯胺酮麻醉致其學齡期及成年后認知功能障礙，海馬齒狀回小膠質細胞和海馬區CX3CR1 蛋白相對表達量減少對其有促進作用。這為下一步麻醉藥的神經毒性研究提供了新方向，也為麻醉藥物在發育期的安全應用提供一些指導。