ADAM17下調(diào)影響NK細胞對非小細胞肺癌殺傷作用的實驗研究

羅小寧，劉潔文，張羽，王祥財，涂福平

（贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州341000）

肺癌是常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率、病死率高，嚴重威脅人類健康[1]。而非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌的亞型，占肺癌的80%～85%[2]。在現(xiàn)有治療模式下，肺癌患者的總體治愈率< 20%，晚期患者5年生存率<5%，因此，探索新的治療模式具有重要意義[3]。隨著腫瘤免疫理論逐漸走向成熟，免疫治療作為一種新興的治療模式，在腫瘤治療中展現(xiàn)出較大潛力。目前，免疫檢查點抑制劑的應用已在晚期肺癌治療中取得突破性進展[4]。自然殺傷（natural killer, NK）細胞是機體固有免疫系統(tǒng)的一種效應細胞，具有強大的抗腫瘤、抗感染等作用，是機體免疫的作用屏障[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子可選擇性地提高NK 細胞數(shù)量和抗腫瘤功能的有效性[7]。解聚素- 金屬蛋白酶17（a disintegrin and metalloprotease 17, ADAM17）可介導黏附因子、細胞因子、生長因子等多種膜分子水解脫落，在調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、凋亡、黏附、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，ADAM17 在非小細胞肺癌組織中高表達，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關[9]。腫瘤細胞的免疫逃逸往往是腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移的總根源，而NK 細胞在宿主抵抗腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的免疫反應中起關鍵作用[10]。本研究將通過研究NSCLC A549 細胞株中ADAM17 下調(diào)對NK 細胞殺傷作用的影響，以期為NSCLC 免疫治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人NSCLC A549 細胞株（貨號：HZ-H122）購自美國ATCC 細胞庫，胎牛血清（貨號：FBS500-S）購自澳大利亞AusGeneX 公司，RPMI-1640 培養(yǎng)液（貨號：GMS12052.4.1）購自美國GENMED 公司，Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（貨號：11668019）購自美國Invitrogen 公司，F(xiàn)icoll 密度梯度分離液試劑盒、NK 細胞激活擴增試劑盒（貨號：P1114、TBDNKKIT）購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，磁性激活細胞分離（MACS）試劑盒（貨號：130-097-240）購自德國Miltenyi Biotec 公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒（貨號：K1002S）購自美國Promega 公司，nonsense siRNA、ADAM17 siRNA 與ADAM17、GAPDH 引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，ADAM17 抗體、γ 干擾素（IFN-γ）抗體、顆粒酶B（GraB）抗體、穿孔素（PFP）抗體、GAPDH 抗體（貨號：ab57484、ab25101、ab4059、ab7203、ab181602）購自美國Abcam 公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔（貨號：0295G-HRP）購自美國Santa 公司，CCK-8 試劑（貨號：CK-04）購自日本同仁化學研究所，MIR-162-PC/MIR-262-PC 型恒溫培養(yǎng)箱購自日本松下株式會社，熒光定量PCR儀（型號：ABI 7500）購自美國Applied Biosystems 公司， 酶標儀、 化學發(fā)光成像系統(tǒng)（型號：MODEL550、ChemiDocXRS）購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 將A549 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 u/mL 青霉素、100 u/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞融合率達到70%～80%時，用胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。

取對數(shù)期A549 細胞以1×104個/孔的密度接種于96 孔培養(yǎng)板，分為正常對照組、陰性對照組和ADAM17 下調(diào)組。其中正常對照組A549 細胞不進行轉(zhuǎn)染，陰性對照組、ADAM17 下調(diào)組A549 細胞使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染nonsense siRNA、ADAM17 siRNA。

1.2.2 NK細胞制備 取健康成年捐贈人外周靜脈血10 mL 于肝素抗凝管中，加預冷PBS，混勻后采用Ficoll 密度梯度離心法離心外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs），預 冷PBS 洗滌，按照MACS 試劑盒操作步驟分離NK 細胞（CD56+CD3-），使用NK 細胞激活擴增試劑盒激活NK 細胞，使用含10%胎牛血清、500 u/mL 重組白細胞介素2 的RPMI 1640 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，保持細胞濃度為1×106個/mL。

1.2.3 qRT-PCR 檢測各組A549 細胞ADAM17 mRNA 表達 將細胞培養(yǎng)48 h，收集細胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用qRT-PCR 檢測ADAM17 mRNA 表達水平，內(nèi)參基因為GAPDH。反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃拉伸1 min，共34 次循環(huán)。ADAM17正向引物：5′-ATCAAACCTTTCCTGCG-3′，反向引物：5′-CAAACCCATCCTCGTCCA-3′，分別為17 和18 bp；內(nèi) 參GAPDH 正向引物：5′-GAAGGT‐GAAGGTCGGAGTC-3′，反向引物：5′-GAAGAT‐GGTGATGGGATTTC-3′，分別為19 和20 bp。Ct 值為擴增產(chǎn)物的熒光信號達到臨界閾值時對應的循環(huán)數(shù)，相對表達量以2-ΔΔCt法表示。

1.2.4 Western blotting 檢測各組A549細胞ADAM17蛋白表達 使用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，使用BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度并定量。電泳分離等量蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉1 h，分別加入AD‐AM17 抗體、GAPDH 抗體（1∶500），4℃孵育過夜，TBST 洗滌后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，免疫反應化學發(fā)光法顯色，Tanon 600 圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像并分析條帶灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH 灰度值。

1.2.5 NK細胞殺傷活性檢測 以正常對照組、陰性對照組和ADAM17 下調(diào)組A549 細胞為靶細胞，NK 細胞為效應細胞，在正常對照組、陰性對照組和ADAM17 下調(diào)組基礎上按20∶1 的效靶比加入100 μL NK 細胞，同時設立相應的空白正常對照組、NK 細胞正常對照組和A549 細胞正常對照組。孵育24 h 后，每孔加入CCK-8 試劑20 μL，繼續(xù)孵育4 h 后，在酶標儀450 nm 處檢測每孔光密度（optical density, OD）值，計算殺傷活性。殺傷活性（%）=1-（實驗組OD 值-NK 細胞正常對照組OD 值）/（A549 細胞正常對照組OD 值-空白正常對照組OD值）×100%。

1.2.6 Western blotting 檢測各組細胞IFN-γ、GraB、PFP 蛋白表達 將各組細胞按20∶1 的效靶比加入100 μL NK 細胞，培養(yǎng)48 h，收集細胞，使用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，使用BCA 蛋白試劑盒測定蛋白濃度并定量。電泳分離等量蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉1 h，分別加入IFN-γ 抗體、GraB 抗體、PFP 抗體、GAPDH 抗體（1∶500），4℃孵育過夜，TBST洗滌后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，免疫反應化學發(fā)光法顯色，Tanon 600 圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像并分析條帶灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH 灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞ADAM17 mRNA相對表達量比較

正常對照組、陰性對照組、ADAM17 下調(diào)組細胞中ADAM17 mRNA 相對表達量分別為（1.03±0.12）、（1.01±0.10）、（0.65±0.07），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=28.096，P=0.000），正常對照組與陰性對照組細胞ADAM17 mRNA 相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），ADAM17 下調(diào)組較正常對照組、陰性對照組降低（P<0.05）。

2.2 各組細胞ADAM17蛋白相對表達量比較

正常對照組、陰性對照組、ADAM17 下調(diào)組細胞中ADAM17 蛋白相對表達量分別為（0.86±0.11）、（0.83±0.13）、（0.38±0.07），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=38.389，P=0.000），正常對照組與陰性對照組A549 細胞中ADAM17 蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），ADAM17 下調(diào)組較正常對照組、陰性對照組降低（P<0.05）。見圖1。

圖1 各組A549細胞中ADAM17蛋白表達

2.3 各組NK細胞對A549細胞的殺傷活性比較

正常對照組、陰性對照組、ADAM17 下調(diào)組NK 細胞對A549 細胞的殺傷活性分別為（30.52±2.85）%、（32.07±2.99）%、（46.88±3.31）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=52.399，P=0.000），正常對照組與陰性對照組NK 細胞對A549 細胞的殺傷活性比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），ADAM17 下調(diào)組較正常對照組、陰性對照組升高（P<0.05）。

2.4 各組細胞中IFN-γ、GraB、PFP蛋白相對表達量比較

各組細胞中IFN-γ、GraB、PFP 蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），正常對照組與陰性對照組細胞中IFN-γ、GraB、PFP 蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），ADAM17 下調(diào)組較正常對照組、陰性對照組升高（P<0.05）。見表1 和圖2。

表1 各組細胞中IFN-γ、GraB、PFP蛋白相對表達量比較 （n=6，±s）

表1 各組細胞中IFN-γ、GraB、PFP蛋白相對表達量比較 （n=6，±s）

組別正常對照組陰性對照組ADAM17下調(diào)組F 值P 值IFN-γ 0.31±0.09 0.36±0.08 0.88±0.12 62.055 0.000 GraB 0.30±0.06 0.28±0.06 0.74±0.10 70.744 0.000 PFP 0.36±0.09 0.37±0.08 0.80±0.14 33.308 0.000

圖2 各組細胞中IFN-γ、GraB、PFP蛋白表達

3 討論

NSCLC 是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、病死率在全球范圍內(nèi)均居惡性腫瘤首位，嚴重影響患者的生命健康[11]。NSCLC 發(fā)病隱匿，多數(shù)患者確診時已處于癌癥中晚期，只能盡量延長其生存時間[12]。目前，手術切除已非最佳治療方式，而化學治療在殺傷腫瘤細胞的同時也在殺死健康細胞，嚴重的毒性反應會導致患者免疫功能降低，嚴重影響患者的生存質(zhì)量[13]。因此，尋找一種療效較好、不良反應少的方法對提高NSCLC 患者生存率、延長生存期、改善生活質(zhì)量具有重要意義。

腫瘤存在免疫監(jiān)視、免疫逃逸等機制，使腫瘤細胞在機體中避開免疫系統(tǒng)的清除，隱匿地發(fā)生、發(fā)展。而免疫治療是一種通過重新激活抵抗癌癥的免疫系統(tǒng)，以達到治療的目的[14]。NK 細胞是具有直接殺傷功能的天然免疫效應細胞，通過識別細胞固有表達受體，無需致敏即可特異性識別病變細胞，發(fā)揮快速殺傷病變細胞的功能[15]。由于NK 細胞具有異體細胞回輸、體內(nèi)存活周期短、無細胞因子風暴、不可預期風險低等優(yōu)勢，其在腫瘤免疫治療中具有巨大的應用潛力[16]。增強NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用是免疫治療的主要手段之一，YAO 等[5]研究表明，羅格列酰胺是癌癥免疫療法中有希望的治療候選藥物，可以通過阻止對NK 細胞介導的殺傷的自噬免疫抵抗發(fā)揮作用。

ADAM17 是一種膜結(jié)合蛋白酶，通過對一些與細胞膜結(jié)合的細胞因子、配體的膜外功能區(qū)進行剪切，使這些細胞因子、配體被活化而調(diào)控下游信號轉(zhuǎn)導途徑，從而影響腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。TSUKERMAN 等[18]研究表明，ADAM17缺陷患者的NK 細胞殺傷力增加。MISHRA 等[19]研究表明，抗ADAM17 單克隆抗體MEDI3622 與腫瘤細胞結(jié)合后，能增強NK 細胞與腫瘤細胞結(jié)合，進而增強人NK 細胞的IFNγ 的釋放。本研究結(jié)果顯示，ADAM17 下調(diào)組ADAM17 mRNA 及蛋白相對表達量較正常對照組、陰性對照組降低，同時NK 細胞對A549 細胞的殺傷活性較正常對照組、陰性對照組升高，提示下調(diào)A549 細胞中ADAM17 表達水平可能有助于NK 細胞識別，并結(jié)合A549 細胞發(fā)揮殺傷作用。有研究發(fā)現(xiàn)，NK 細胞中含有大量GraB、PFP蛋白，活化后的NK細胞不僅產(chǎn)生IFN-γ，還會釋放GraB、PFP 蛋白，在天然免疫及殺死靶細胞過程發(fā)揮重要作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，成功下調(diào)A549 細胞中ADAM17 表達水平后，細胞IFN-γ、GraB、PFP 蛋白相對表達量均升高，推測下調(diào)A549細胞ADAM17 表達水平后，增強了NK 細胞對A549細胞的識別，導致NK 細胞活化釋放IFN-γ、GraB、PFP 增多，增強NK 細胞對A549 細胞的殺傷作用。

綜上所述，NSCLC A549 細胞株中ADAM17 下調(diào)可以增強NK 細胞的殺傷作用，抑制腫瘤免疫逃逸，這可能為NSCLC 免疫治療提供新靶點。