紫杉醇對視網膜色素上皮細胞功能的破壞及其潛在機制

葉亞婷,竇國睿,常天芳 ,孫 宇,牛亞麗1，,周子義 ,儲昭節

0引言

紫杉醇(paclitaxel, PTX)是一種微管穩定藥物，已獲得美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration, FDA)的批準，可用于治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肉瘤、淋巴瘤和白血病等多種腫瘤的抗腫瘤藥物[1]。但需要注意的是其應用所并發的諸多不良反應給腫瘤患者日常管理帶來了一些困難。較為常見且報道較多的不良反應主要包括骨髓抑制、過敏反應、消化系統反應、神經毒性、肌肉/關節痛、手足麻木以及肝臟損傷等[2]。近些年關于PTX治療引起黃斑水腫[3]陸續被報道，為一種PTX使用相關的少見眼部并發癥。目前關于PTX導致黃斑水腫的研究較少且機制不明，有文獻猜測PTX導致的黃斑水腫與視網膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)細胞損害[4]和視網膜屏障[5]有關，但尚未有研究證實。為明確PTX對RPE細胞存在潛在影響，我們應用體外培養的細胞作為實驗對象，研究其對RPE細胞及屏障功能的影響，以闡明PTX致黃斑水腫的發病機制。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑人視網膜色素上皮細胞(ARPE-19)購自于賽百慷公司(中國)。DME/F12培養基劑購自HyClone公司(美國)。胎牛血清等培養試劑購自Gibco公司(美國)。PTX購自于MedChemExpress(MCE)公司(美國)。流式細胞儀以及配套試劑盒購自Invitrogen(美國)。CCK8試劑盒購自武漢華美公司(中國)。酶標儀(ELX 800,Bio-Teck,美國)。Cleaved-caspse-3、Bcl-2、Bax、ZO-1、Occludin購自Abcam公司(英國)。β-actin抗體以及二抗購自CST公司(美國)。

1.1.2細胞的培養及分組將ARPE-19細胞系在含10%胎牛血清、1%雙抗的DME/F12培養基中培養。將ARPE-19細胞分為五組:對照組(正常培養基)、0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX組。當細胞融合至60%～70%時，換無血清培養基繼續培養12h后加不同濃度的PTX刺激12、24、36、48、72h。

1.2方法

1.2.1CCK8檢測細胞增殖情況將ARPE-19細胞以每毫升2×104個接種于96孔板中，每孔加入細胞懸浮液100μL。置細胞于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養，當細胞貼壁后換無血清培養基繼續培養12h后按對照組、0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX刺激12、24、36、48、72h，每孔加入10μL CCK8溶液繼續孵育，酶標儀測定450nm處的吸光度。

1.2.2流式細胞儀檢測細胞凋亡情況取對數生長期的細胞按每毫升1×106個接種于6孔板，置細胞于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養，當細胞貼壁后換無血清培養基繼續培養12h后按對照組、0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX刺激12、24、36、48、72h，胰酶消化加1×Binding Buffer輕輕重懸細胞，1000r/min離心5min。加入Annexin V-FITC，室溫避光孵育15min。加入PI染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置5min。流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞周期細胞培養方法同1.2.2，當細胞貼壁后換無血清培養基繼續培養12h后按對照組、0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX刺激24h,0.1%胰酶消化,70%冷乙醇固定4h,Triton-100震蕩,RNA酶37℃水浴30min,碘化丙啶染色后,置于流式細胞儀進行檢測分析細胞周期。

1.2.4免疫熒光觀察細胞形態將ARPE-19細胞按每毫升2×105個接種于共聚焦培養皿中,當細胞生長至70%時換無血清培養基繼續培養12h之后以換液的方式將對照組和0.05mg/L PTX的培養基加入共聚焦培養皿繼續培養24h。4%多聚甲醛固定30min。室溫下,在1%BSA和0.5% Trition X-100(PBS稀釋)的封閉液中封閉30min。加入兔源鬼筆環肽(Phalloidin)一抗(1∶200)，一抗用上述封閉液稀釋,4℃濕盒內孵育過夜。PBS清洗3次,每次5min。孵二抗(1∶200)避光室溫1h使用含有DAPI的封片劑染色細胞核并封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5細胞屏障模型的建立及檢測提前1h將Transwell小室浸泡于培養基中,將ARPE-19細胞按每毫升5×104個接種于微孔孔徑0.40μm的Transwell小室內底面,37℃、5% CO2培養箱中孵育,無細胞生長僅有濾膜的小室作為空白組。所有的Transwell上室加入500μL細胞培養液,下室加入1500μL培養液以保持靜水壓相等。用倒置相差顯微鏡觀察細胞生長狀況，當細胞開始融合時換為低血清(1% FBS)培養基繼續培養,之后隔天以半換液形式進行換液。用TER儀測定跨上皮細胞電阻,單位為Ω·cm,之后每日同一時間點測TER共6次。空白組用同樣的方法測定,作為背景電阻值；實驗組的TER值為所測電阻值減去背景電阻值乘以濾膜面積。從3個取液處進行測量,每孔電阻的測量至少重復3遍取其平均值。當觀察到細胞呈緊密連接的六邊形且連續3d電阻穩定即認為細胞極化形成。當細胞極化形成時,以換液的方式將對照組和含0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX的培養基加入Transwell上室,分別在加藥后3、6、12、24h測量其電阻值變化。同時，當細胞極化形成時，以換液的方式將對照組和含0.05mg/L PTX的培養基加入Transwell上室刺激24h后，提取總蛋白檢測屏障功能相關蛋白的表達。

1.2.6Westernblot檢測蛋白表達水平將ARPE-19細胞接種于6cm培養皿中,細胞生長至70%時換無血清培養基繼續培養12h之后以換液的方式將對照組和0.05mg/L PTX 的培養基加入培養皿繼續培養24h后,加細胞裂解液提取總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度,在制備的SDS-PAGE加每孔30μg蛋白用于電泳分離,采用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上,轉膜后置于5%的脫脂牛奶(TBST)中室溫封閉1.5h。孵兔源一抗(1∶1000稀釋)Cleaved-caspse-3、Bcl-2、Bax 4℃過夜,孵二抗室溫1h。通過ECL化學發光液在暗室中對蛋白質膜進行成像。并通過ImageJ Program掃描和測量條帶的相對光密度。β-actin為內參。

2結果

2.1CCK8檢測細胞增殖情況PTX抑制ARPE-19細胞增殖，且與時間和藥物濃度呈依賴性(圖1)。藥物處理12h及低濃度(0.005mg/L)的PTX處理24h后對細胞增殖基本無影響影響，其細胞存活率基本在96.7%左右，處理36h，細胞增殖開始受影響；其余濃度處理下，不同時間點細胞增殖明顯受到抑制，特別是高濃度(5mg/L)的PTX處理72h后，細胞存活率僅為28.9%。

圖1 各組細胞不同時間點增殖圖。

2.2流式細胞儀檢測細胞凋亡情況PTX引起ARPE-19細胞的凋亡與時間和藥物濃度呈依賴性(圖2)。0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX藥物處理12h細胞凋亡基本不受影響，其凋亡指數保持在6左右；除高濃度(5mg/L PTX)處理24h細胞凋亡明顯增加，其凋亡指數為15.93，其余不同濃度細胞凋亡基本不受影響；在0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX藥物刺激36、48h細胞凋亡均受影響。而當藥物刺激72h時，細胞基本壞死。

圖2 各組細胞不同時間點凋亡圖。

2.3流式細胞儀檢測細胞周期對照組、0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX作用24h后ARPE-19細胞明顯阻滯于G2/M期(圖3)。且隨著藥物濃度增加細胞周期變化更明顯。

圖3 流式細胞儀檢測細胞周期 A:對照組；B：0.005mg/L PTX組；C：0.05mg/L PTX組；D：0.5mg/L PTX組；E：5mg/L PTX組。

2.4免疫熒光觀察細胞形態0.05mg/L PTX處理24h后，細胞形態發生明顯改變(圖4)。正常細胞呈現扁梭形、圓形或多角形的細胞形態，貼壁良好。加藥物組中，細胞數相對減少且細胞發生皺縮，細胞骨架不清晰細胞形態趨于圓形。

圖4 免疫熒光觀察細胞形態。

2.5細胞屏障模型的建立及檢測當細胞培養2wk之后極化逐步形成(圖5A)，其跨上皮電阻保持在70Ω·cm2加藥物刺激后細胞屏障功能被破壞，同一時間點下藥物濃度高者細胞屏障受損更嚴重(圖5B)。0.05mg/L PTX作用細胞24h后，細胞間緊密連接蛋白ZO-1和跨膜蛋白Occludin的表達較對照組明顯降低(圖5C)，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

圖5 細胞屏障模型檢測 A:細胞極化形成跨上皮電阻圖；B:藥物刺激后不同時間點細胞跨上皮電阻示意圖；C:細胞間緊密連接蛋白ZO-1和跨膜蛋白Occludin相對表達圖。

表1 兩組細胞相關蛋白表達情況比較

2.6Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達情況與對照組相比，0.05mg/L PTX組Bax、Cleaved-caspase-3蛋白的相對表達水平均顯著升高,Bcl-2蛋白的相對表達水平均顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1，圖6。

圖6 Western blot檢測凋亡相關蛋白表達情況 A:Bax蛋白相對表達圖；B:Bcl-2蛋白相對表達圖；C:Cleaved-caspase-3蛋白相對表達圖。

3討論

PTX是FDA批準的第一個天然植物化學藥物,是一種高效低毒的光譜抗癌藥物,其分子式為：C47H51NO14,分子量為853.92。1992年由美國FDA批準上市的三環二萜類抗腫瘤藥物[1]，1971年由Wani等[6]從短葉紅豆杉中分離出來化合物紅豆杉。其在抗腫瘤方面的療效顯著，在眼部的不良反應引起了眼科醫生的注意。

根據近幾年關于PTX導致黃斑水腫病例報道總結，PTX所導致的黃斑水腫，患者最初出現雙側視力下降，眼前節檢查顯示結果正常。除雙側黃斑囊性改變外，眼底檢查結果均在正常范圍內。熒光素血管造影(fundus fluorescence angiography, FFA)顯示無滲漏或滲漏極小，光學相干斷層掃描(optical coherence tomography, OCT)顯示黃斑中心凹厚度增加[7-9]。PTX引起黃斑水腫的病理機制尚不明確，沒有推薦的治療指南。治療策略主要為停止化療，也有學者嘗試碳酸酐酶抑制劑[10]、皮質類固醇藥物[8]以及抗血管內皮生長因子[11]藥物進行治療，但治療效果都不顯著。

本實驗結果表明，PTX可以抑制體外培養的ARPE-19細胞生長，且呈時間、濃度依賴性,0.05mg/L PTX處理細胞36h細胞增殖受到抑制。在早些年，有研究者發現PTX可抑制原代ARPE-19的增殖，且使細胞表面微絨毛減少，細胞器減少等[12]。而且長時間(72h)的藥物處理細胞基本壞死，短時間較高濃度的藥物處理細胞出現凋亡；凋亡標志物Cleaved-caspase-3較對照組顯著增加，促凋亡因子Bax及Bcl-2抗凋亡因子是調節凋亡的關鍵因子。在細胞受刺激下，細胞線粒體外膜遭到破壞，細胞膜通透性增加，進而激活胱天蛋白酶3(Caspase-3)，誘導細胞凋亡[13]。在早前的研究中，羅莉霞等[14]研究發現PTX可通過誘導兔晶狀體上皮細胞的凋亡而抑制細胞增殖。

血-視網膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)包括內BRB(inner blood-retinal barrier,iBRB)和外BRB(outer blood-retinal barrier,oBRB)，它們分別由視網膜毛細血管內皮細胞(retinal capillary endothelial cells，RCEC)和RPE細胞與Bruch膜和脈絡膜毛細血管共同形成[15]。眾所周知，人類視網膜的三分之二通過iBRB由視網膜毛細血管提供營養，其余部分通過oBRB由脈絡膜毛細血管提供[16-17]。由RPE形成的oBRB對于維持視網膜穩態至關重要[18]。oBRB調控著視網膜與脈絡膜循環之間的養分和代謝產物進出，是視網膜維持生理狀態和功能的重要結構基礎之一[19]。oBRB的建立取決于視網膜最外層的單層排列的六角形細胞——RPE細胞間的緊密連接(tight junction,TJ)和細胞極化形態[20]。因此，如何維持或重建oBRB結構和功能，是維持視網膜正常穩態和生理功能的關鍵，也是多種視網膜疾病防治的潛在靶點。如在糖尿病性視網膜病變中，oBRB的破壞起著重要作用。一項研究報告稱，oBRB占糖尿病視網膜總血管滲漏的三分之一[21]。年齡相關性黃斑病變(age-related macular degeneration,ARMD)，oBRB的完整性可防止脈絡膜血管反應侵入視網膜并將干性ARMD轉變為濕性ARMD[19]。本研究發現與對照組相比，0.05mg/L PTX組跨膜蛋白Occludin和結構連接蛋白ZO-1的相對表達水平顯著降低(P<0.05)，同時0.05mg/L PTX組細胞跨上皮電阻顯著降低。根據本研究，我們推測在疾病發生過程中，RPE細胞的增殖受到抑制、凋亡增加、形態異常及極化丟失會引起oBRB的破壞進而導致黃斑水腫的發生。

然而這種特殊的黃斑水腫，與其他黃斑水腫，如糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)，繼發于視網膜靜脈阻塞(macular edema secondary to retinal vein occlusion,RVO-ME)或葡萄膜炎相比，其特點是不表現出經典的眼底血管造影結果。在PTX引起的黃斑水腫中，OCT顯示黃斑中心凹不同程度增厚，FFA檢查未發現明顯滲漏源。此外，黃斑水腫在停藥后的不同時間會自行消失。這種特殊類型的黃斑水腫迄今為止還沒有明確的發病機制的研究發表，只有病例報道。對這類黃斑水腫的發病機制有不同的推測：(1)有學者認為藥物引起的黃斑水腫可能是由于PTX抑制細胞內微管重組引起的細胞毒性所致[9]；(2)Nomi等[7]認為其機制可能是細胞內液體在內部積累和BRB的微小損害；(3)也可以解釋血管造影的結果，有學者將無滲漏或極少滲漏的成像結果解釋為Müller細胞的細胞毒性。因為Müller細胞負責維持視網膜的神經感覺滲透梯度，它們的功能障礙導致細胞內液體的積累[22]。那么，此類黃斑水腫到底是oBRB的破壞進而導致的水腫還是由于Müller細胞的細胞毒性所致，或者說是兩者均參與仍還需進一步研究證明。目前我們的研究結果表明oBRB的破壞是參與此類黃斑水腫的發病機制。

綜上所述，抗腫瘤藥物PTX可對視網膜存在潛在毒性作用，其可能通過抑制RPE細胞的增殖、促進凋亡、改變細胞極化形態等造成視網膜外屏障的破壞，從而誘發視網膜黃斑水腫，提示腫瘤患者使用PTX治療的疾病管理中需要監測眼部副作用。