黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8次生代謝產物研究

尤夢瑤, 閆佳佳, 萬 璐, 吳 桐, 鄭春英

(1.黑龍江大學 農業微生物技術教育部工程研究中心, 哈爾濱 150080;2.黑龍江大學 生命科學學院 黑龍江省普通高等學校微生物重點實驗室, 哈爾濱 150080;3.黑龍江大學 生命科學學院 黑龍江省普通高等學校分子生物學重點實驗室, 哈爾濱 150080)

0 引 言

黃芪為豆科植物蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.Mongholicus (Bge.) Hsiao)或膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.)的干燥根[1]，含有黃酮類、皂苷類和多糖等多種活性成分[2]，具有抗腫瘤、抗衰老、免疫調節、抗病毒性心肌炎和降血糖等作用[3]，是既食又藥的功能性保健食品[4]，深受人們喜愛。

近年來，對黃芪內生菌的研究報道[5-6]越來越多，但是這些報道大多局限在對黃芪內生菌的分離和鑒定方面，對其次生代謝產物的系統研究鮮有報道。本文選取分離自黃芪根部的內生枯草芽孢桿菌HS8(Baci-llussubtilis)為研究對象，作為典型工業模式微生物[7]，枯草芽孢桿菌 (B.subtilis)是中國農業部和美國食品藥物管理局(FDA)認定的安全菌株[8-9]，含有內酯類、多肽、萜類、異香豆素類、生物堿類和有機酸[10]等活性物質，具有抗腫瘤[11]、抗菌[12]、抗炎[13]和抗潰瘍[14]等活性作用，在藥品生產[15]和食品發酵[16]等方面被廣泛應用。本文對黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8(B.subtilis)發酵液中的次生代謝產物進行了系統研究，旨在深入開發利用該菌株，為其次生代謝產物的獲取及工業化生產奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1儀器與試劑

高效液相色譜儀(FL2200，浙江溫嶺福立分析儀器有限公司)；超聲波清洗器(KQ-100DE，昆山市超聲儀器有限公司)。

乙腈和甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.1.2供試菌

內生細菌HS8分離自黑龍江省大興安嶺地區野生黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)根，委托上海生工生物工程股份有限公司鑒定為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，現保藏于黑龍江大學生命科學學院生物制藥專業實驗室。

1.1.3培養基

營養瓊脂(Nutrient agar, NA)和營養肉湯(Nutrient broth, NB)培養基：見文獻[17]。

1.2 實驗方法

1.2.1黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8的抗菌活性分析

(1) 發酵液的制備

將內生枯草芽孢桿菌HS8接種于NA培養基，恒溫活化培養(37 ℃，3 d)，取活化后的內生枯草芽孢桿菌HS8，制備1×107CFU·mL-1的種子液(制備方法：在無菌條件下接種于60 mL的NB培養基中，37 ℃，120 r·min-1，3 d)；以5%接種量將內生枯草芽孢桿菌HS8的種子液接種到300 mL的NB培養基中，恒溫培養(37 ℃，120 r·min-1，5 d)，過濾，即得發酵液。

(2) 黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8的抗菌活性分析

取發酵液，減壓濃縮至100 mL，采用乙酸乙酯萃取(3×100 mL)，合并乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮，凍干。取凍干粉5 mg，以10 mL甲醇溶解，作為濃度為500 μg·mL-1的供試品液；以鏈霉素溶液和制霉菌素溶液(0.1 mg·mL-1)作為陽性對照，甲醇溶液作為溶劑對照。參閱文獻[18]，采用瓊脂擴散法對內生枯草芽孢桿菌HS8發酵液進行抗菌活性的測定。

1.2.2黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8的次生代謝物分析

(1) 液相色譜條件

Venusil XBP-C18柱(φ4.6 mm×250 mm，5 μm，USA)；流動相①：甲醇-水-冰醋酸(50∶49.7∶0.3)；流動相②：甲醇-水-冰醋酸(30∶69.5∶0.5)；流動相③：乙腈-水(92.5:7.5)；流動相④：甲醇-水(50∶50)；流速：1 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。

(2) 對照品及對照藥材液的制備

分別精確稱取適量的原兒茶酸、阿魏酸和β-谷甾醇對照品，加入色譜級甲醇，分別制成0.2 mg·mL-1的對照品溶液；分別稱取黃芪根和黃芪莖干粉各10 g，加入100 mL甲醇，超聲提取1 h，過濾后于50 ℃減壓濃縮至10 mL，即得黃芪對照藥材液。

(3) 供試品液的制備

采用1.2.1的方法制備發酵液，依次采用氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇進行萃取(3×100 mL)，合并萃取液，低溫濃縮后，分別溶于10 mL色譜級甲醇，即得內生枯草芽孢桿菌HS8發酵液氯仿萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、水飽和正丁醇萃取部位。

取10 L HS8發酵液緩慢通過D101大孔樹脂柱(控制流速)，采用乙醇梯度洗脫(乙醇體積分數分別為：30%、50%、70%和90%)，收集不同洗脫餾分，對不同洗脫餾分進行活性成分分析。

1.2.3黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8次生代謝產物分離

根據分析結果進行有目的的分離。

選取1.2.2(3)中30%乙醇洗脫部位進行聚酰胺柱分離，采用氯仿∶甲醇(10∶1)洗脫，收集洗脫液(10 mL/組分)，隨行TLC檢測跟蹤，合并20～70號組分，回收溶劑，進行硅膠柱色譜分離，采用氯仿∶甲醇(2∶1)洗脫，收集洗脫液(10 mL/組分)，隨行TLC檢測跟蹤，合并100～127號組分，回收溶劑，重結晶，得化合物A。

選取1.2.2(3)中90%乙醇洗脫部位進行聚酰胺柱分離，依然采用乙醇梯度洗脫，隨行TLC檢測跟蹤，取90%乙醇洗脫部位濃縮近干后進行硅膠柱分離，以石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)洗脫，收集洗脫液(10 mL/組分)，隨行TLC檢測跟蹤，合并25～36號組分，回收溶劑，重結晶，得化合物B。

選取1.2.2(3)中乙酸乙酯萃取部位進行硅膠柱分離，以石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)進行洗脫，收集洗脫液(10 mL/組分)，隨行TLC檢測跟蹤，合并125～190號組分，回收溶劑后進行硅膠柱色譜純化，采用石油醚：乙酸乙酯(1∶2)洗脫，收集洗脫液(10 mL/組分)，隨行TLC檢測跟蹤，合并17～30號組分，重結晶，得化合物C。

2 結果分析

2.1 黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8的抗菌活性分析

對黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8發酵液進行抑菌活性篩選，結果如表1所示。由表1可知，黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8發酵液對11種供試細菌以及供試真菌均有不同程度的抑制作用，陰性對照的甲醇無干擾，且抑菌譜廣，尤其對肺炎克雷伯菌、銅綠假單孢菌和短小芽孢桿菌的抑制效果最為顯著，抑菌圈直徑分別達到(20.8±0.1)、(20.7±0.3)和(20.5±0.1) mm，對糞腸球菌的抑制效果也較為明顯，抑菌圈直徑達到(19.3±0.1) mm。上述結果表明，黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8發酵液具有較好的抗菌活性，可應用于抗菌劑的開發。

表1 HS8發酵液抗菌活性結果(mm)

對黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8發酵液的水飽和正丁醇、乙酸乙酯以及氯仿萃取部位中的次生代謝產物進行分析，結果如圖1所示。由圖1可知，黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8發酵液的水飽和正丁醇、乙酸乙酯以及氯仿萃取部位中均含有多種次生代謝產物，其中，乙酸乙酯萃取部位含有的活性成分較多；以黃芪莖和根生藥為對照，內生枯草芽孢桿菌HS8的乙酸乙酯萃取部位在保留時間為10 min和17 min時出現與黃芪生藥相同的色譜峰。因此，選取黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8發酵液的乙酸乙酯萃取部位進行次生代謝產物的分離。

2.2 黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8的次生代謝產物分析

注： A：黃芪根樣品；B：黃芪莖樣品；C：NB空白對照；D：HS8水飽和正丁醇萃取部位；E：HS8乙酸乙酯萃取部位；F：HS8氯仿萃取部位圖1 黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8不同萃取部位次生代謝產物分析Fig.1 Analysis of secondary metabolites in different extracted parts of endophytic Bacillus subtilis HS8

對1.2.2(3)中的30%乙醇洗脫部位采用1.2.2(1)中流動相②進行次生代謝產物分析，結果如圖2所示，對1.2.2(3)中90%乙醇洗脫部位1.2.2(1)中流動相③進行次生代謝產物分析，結果如圖3所示。由圖2可以看出，30%乙醇洗脫部位中在與原兒茶酸對照品相同的保留時間內出現相同的色譜峰。由圖3可以看出，90%乙醇洗脫部位在與β-谷甾醇對照品相同的保留時間內出現相同的色譜峰，并且空白培養基無干擾。說明在30%乙醇洗脫部位及90%乙醇洗脫部位中分別含有原兒茶酸及β-谷甾醇，可以針對這些活性部位有目的的進行分離純化。此外，對1.2.2(3)中50%及70%乙醇洗脫部位中次生代謝產物進行了分析，尚未檢測到已知化合物。

注：A：原兒茶酸對照品；B：D101大孔樹脂柱30%乙醇洗脫部位；C：NB空白對照

elution fraction 注：A：β-谷甾醇對照品；B：D101大孔樹脂柱90%乙醇洗脫部位；C：NB空白對照

2.3 黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8次生代謝產物分離

從黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8中分離得到3個化合物。

化合物A：白色針狀結晶，易溶解于甲醇、乙醇和氯仿等有機溶劑。以原兒茶酸為對照品，選用1.2.2(1)中流動相②，采用標準加入法對化合物A進行HPLC分析，并對其純度進行測定，結果如圖4和圖5所示。由圖可知，化合物A為純度較高的單一化合物，純度為99.48%，與原兒茶酸對照品混合后出現單一色譜峰，說明化合物A可能為原兒茶酸，因此采用1H-NMR對其結構進行確認。

圖4 化合物A的高效液相色譜圖

圖5 化合物A與原兒茶酸混合的高效液相色譜圖

化合物A的1H-NMR鑒定結果：1H-NMR(400 MHz，MeOD)：δ7.43(1H，s，H-2)，7.41(1H，d，J=1.9 Hz，H-6)，6.83(2H，dd，J=8.0 Hz，H-5)，苯環上有3個取代基，上述數據與文獻[19]報道的原兒茶酸一致，綜合TLC、HPLC和1H-NMR分析結果，確定化合物A為原兒茶酸。

化合物B：白色結晶，難溶解于甲醇，易溶于氯仿。以β-谷甾醇為對照，選用1.2.2(1)中流動相③，采用標準加入法對化合物B進行HPLC分析，并對其純度進行測定，結果如圖6和圖7所示。由圖可知，化合物B為純度較高的單一化合物，純度為98.21%，與β-谷甾醇對照品混合后出現單一色譜峰，說明化合物B可能為β-谷甾醇，因此采用1H-NMR對其結構進行確認。

圖6 化合物B的高效液相色譜圖

圖7 化合物B與β-谷甾醇混合的高效液相色譜圖

化合物B的1H-NMR鑒定結果：1H NMR (400 MHz，MeOD):δ5.34 (1H，s，H-6 )，1.02 (2H，s，H-19 )，0.95 (2H，d，J=6.4 Hz，H-21)，0.86 (3H，dd，J=15.5，7.8 Hz，H-26)，0.72 (1H，s，H-18)，以上數據與文獻[20]報道的β-谷甾醇一致，綜合TLC、HPLC和1H-NMR分析結果，確定化合物B為β-谷甾醇。

化合物C：透明針狀結晶，微溶于氯仿，易溶于甲醇等有機溶劑。以阿魏酸為對照，選用1.2.2(1)中流動相④，采用標準加入法對化合物C進行HPLC分析，并對其純度進行測定，結果如圖8和圖9所示。由圖可知，化合物C為純度較高的單一化合物，純度為98.57%，與阿魏酸對照品混合后出現單一色譜峰，說明化合物C可能為阿魏酸，因此采用1H-NMR對其結構進行確認。

圖8 化合物C的高效液相色譜圖

圖9 化合物C與阿魏酸混合的高效液相色譜圖

化合物C的1H-NMR鑒定結果：1H-NMR (400 MHz，MeOD)：δ7.59 (1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，7.18 (1H，d，J=1.7 Hz，H-2)，7.06 (1H，dd，J=8.2，1.8 Hz，H-6)，6.81 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.31 (1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，3.89 (s，3-OCH3)。由1H-NMR數據分析可得，化合物C中存在反式烯烴，苯環為1′，3′，4′取代，4′取代基為—OCH3。以上數據與文獻[21]報道的阿魏酸一致，綜合TLC、HPLC和1H-NMR分析結果，確定化合物C為阿魏酸。

化合物A～C結構如圖10所示。

圖10 化合物A～C的結構

3 討 論

眾所周知，植物內生菌次生代謝產物豐富，是新型次生代謝產物資源[22]。通常，內生菌次生代謝產物含量較低，這為其研究帶來很大困難。為了避免分離的盲目性，基于植物內生菌能夠產生與宿主植物相同或相似的活性成分的理論，選取抑菌活性較好的黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8為研究對象，采用HPLC法對其發酵液中可能存在的次生代謝產物進行分析，并與黃芪生藥進行對比分析。在分析結果的基礎上，有針對性地設計次生代謝產物分離工藝，分離得到3個具有較好抗菌活性、且與宿主植物黃芪相同的次生代謝產物。其中化合物A為原兒茶酸，該化合物是一種在植物界中分布廣泛的天然酚酸，具有抗菌、抗氧化和抗腫瘤等活性作用[23]，同時，該化合物也是川芎嗪等合成藥物的前體物質[24]；化合物B是β-谷甾醇，β-谷甾醇是一種常見的植物固醇類化合物[25]，在抗炎、抗癌和降血糖等方面均表現出優異的生物活性[26]；化合物C為阿魏酸，阿魏酸是一種廣泛存在于植物中的有機酸，具有抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集、抗氧化、抗菌消炎和抗紫外線輻射等作用[27]，因其幾乎沒有毒副作用，所以具有較高的藥用價值[28]。

盡管已從枯草芽孢桿菌發酵液中分離出多種次生代謝產物，但從枯草芽孢桿菌中分離、純化原兒茶酸(A)、β-谷甾醇(B)及阿魏酸(C)的研究未見報道。上述研究豐富了枯草芽孢桿菌次生代謝產物庫，為發現先導化合物奠定了基礎。因此，內生枯草芽孢桿菌HS8是一株具有深入開發應用價值的內生枯草芽孢桿菌。此外，在內生枯草芽孢桿菌HS8次生代謝產物的分離過程中，也分離得到了多種其他化合物，但得率較低，不能進行結構鑒定。后續將針對黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8次生代謝產物分離過程中存在的各種問題進行相應的研究，為提高內生枯草芽孢桿菌HS8次生代謝產物產量及工業化生產奠定基礎。

4 結 論

在黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8發酵液中，既含有與宿主植物黃芪相同/相似的次生代謝產物，也存在大量不同的次生代謝產物，說明黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8不僅為黃芪次生代謝產物產生菌，也可以作為目的菌株進行微生物發酵生產其他活性代謝物。因此，黃芪內生枯草芽孢桿菌HS8是一株值得深入開發應用的枯草芽孢桿菌。