熱應激對魚類hsp70基因和caspase-3基因影響的研究進展

張華琨 王冠 王秀利

摘要：魚類對溫度的適應因其種類不同而有差異，這是長期進化和演變的結果。本文通過對不同種魚類的最大臨界溫度和高起始致死溫度這兩個熱耐受性指標、耐熱相關基因的表達等進行了綜述，發現影響魚類耐熱能力的重要因素是基礎水溫和溫度升高的速率，以及生物的生理及遺傳，進而掌握不同魚類的耐熱能力，并對在高溫脅迫下表達差異顯著的hsp70基因和caspase-3細胞凋亡相關基因進行了分析討論;發現熱應激使hsp70在魚類體內的合成速度顯著增加，以提高魚類的抗應激能力，同時也會使caspase-3基因被激活，誘導細胞發生凋亡。

關鍵詞：魚類;熱耐受性;hsp70基因;caspase-3基因

生態環境中的各類因子會對生物的生長繁殖產生影響，其中限制性因子是限制生物生長繁殖的關鍵因素，如溫度、鹽度、光照、溶氧、pH值這些限制性因子都會對生物的正常生命活動產生限制性作用[1]。而在眾多環境因子中，影響生物生長發育、繁殖的一個關鍵因素是溫度。魚類作為水生變溫動物，對水溫感知迅速，但自身體溫調節能力較弱，因而體溫容易受到外界環境溫度影響，隨環境溫度變化而變化。其生長繁殖與環境生活條件聯系緊密。水溫對魚類的生長、繁殖、免疫等相關活動均有影響，具有多方面的作用。當環境中水溫發生變化時，魚類的生理機能、攝食量等方面會隨之發生改變。相關研究表明，魚類自身能夠正常生長發育是因為對外界環境的不斷適應，而溫度、光強、pH值、鹽度、溶氧、營養物質、密度等是影響魚類生長發育的主要外界因素[2]。同時魚類對溫度應激反應敏感，機體在溫度超出一定范圍后，就會自發進行一系列生理調節來幫助自身適應新的環境，以維持內環境穩態，即為熱耐受性[3]。

在全球氣候變暖及熱污染越來越嚴重的情況下，已有學者通過研究魚類的最大臨界溫度（Criticalthermalmaximum，CTM）和高起始致死溫度（Upperincipientlethaltemperature，UILT50）這兩個熱耐受性指標來探究不同魚類的耐熱能力。本文通過對不同種魚類的最大臨界溫度和高起始致死溫度這兩個熱耐受性指標、耐熱相關基因的表達等進行綜述，為今后魚類耐高溫方面的研究提供了思路。

1魚類的熱耐受性指標

研究顯示，當水溫上升到一定程度，魚體逐漸出現身體缺乏平衡、呼吸困難、喪失游泳能力等行為，此時的溫度值即為高溫耐受極限值或稱最大臨界溫度。將50%的生物個體不能長期生存下去的溫度定義為起始致死溫度。該起始致死溫度的耐高溫方向即為高起始致死溫度。魚類因種類不同而具有不同的臨界溫度、致死溫度以及熱適應能力。一般來說，同科魚類的最大臨界溫度也存在一定差異，暖水性魚類對低溫敏感并能耐受高溫，而冷水性魚類則是對高溫更敏感，能夠適應低溫環境。相關研究還發現，魚類的熱耐受性受溫度馴化的影響，其臨界溫度或初始致死溫度與馴化溫度呈線性相關關系[4]。

1.1不同魚類的最大臨界溫度

就暖水性魚類來說，點籃子魚在基礎水溫19～31℃條件下，CTM值為37.26～39.90℃[5];南亞野鯪在基礎水溫25～35℃條件下，CTM值為40.2～42.2℃[6];短體下眼鲿在基礎水溫15～36℃條件下，CTM值為34.86～42.79℃[7];梭魚在25～34℃條件下，CTM值為40.8～42.5℃[8]。

就溫水性魚類來說，鯉在基礎水溫25～35℃條件下，CTM值為39.7～42.9℃[6];南方鲇在基礎水溫10～30℃條件下，CTM值為34.13～39.41℃[9];中華鳑鲏在基礎水溫20～25℃條件下，CTM值為35.82～38.01℃[10];在基礎水溫10～30℃條件下，藍鰓太陽魚CTM值為33.9～41.2℃，長耳太陽魚CTM值為34.8～40.0℃[11];在基礎水溫20～30℃條件下，斑點叉尾鮰CTM值為35.4～38.5℃，大口黑鱸CTM值為36.4～40.3℃[12];

就冷水性魚類來說，尖頭鳉在基礎水溫14～29℃條件下，CTM值為32.29～35.71℃[12];虹鱒的在基礎水溫10～20℃條件下，CTM值為28.0～29.8℃[13];硬頭鱒在基礎水溫14℃條件下，CTM值為24.3℃[13]。

由此可得，魚類的熱耐受性會受到溫度馴化的影響，表現為當馴化溫度上升時，最大臨界溫度也隨之升高，這表明魚類對溫度的適應性可隨外界環境溫度變化而改變，即高溫馴化可幫助魚類提高耐熱能力，同時表明物種的適溫能力與其生活環境溫度密切相關。并且有研究表明，CTM比其他任何方法更接近自然條件[14]，因此，它可以廣泛地作為一種比較方法來量化不同物種之間的熱容差異。

1.2不同魚類的高起始致死溫度

在暖水性魚類中，在5～26℃條件下，許氏平鮋UILT50值為25.1～29.8℃，褐菖鮋UILT50值為24.3～29.6℃，矛尾鰕虎魚UILT50值為28.6～35.2℃[15];梭魚在25～34℃條件下，UILT50值為36.8～38.5℃[8]。

在溫水性魚類中，南方鲇的UILT50為39.41℃[9];中華鳑鲏的UILT50為40.26℃[10];鯽的UILT50為35.30℃[16]。

在冷水性魚類中，在基礎水溫5～26℃條件下，大瀧六線魚UILT50值為22.7～29.1℃，石鰈魚UILT50值為25.7～30.0℃[15]。

綜上所述，最大臨界溫度和高起始致死濃度是生物耐熱性實驗中最重要的也是最具研究意義的兩個因素，并且一般隨基礎水溫的升高呈現上升趨勢。研究發現，生物的CTM值在相同基礎水溫條件下均高于UILT50值[17]。影響魚類耐熱能力的重要因素是基礎水溫和溫度升高的速率，且不同物種間的熱耐受性存在顯著差異，而這種差異與生物的地理分布和適宜的生長溫度等因素有很大關聯。一般來說，暖水性生物比冷水性生物的耐熱能力強，但耐低溫能力低于冷水性生物。此外生物的生理及遺傳等因素也可能是造成耐熱能力不同的原因。

2魚類的高溫耐受相關基因

2.1魚類hsp70基因

近年來研究表明，熱休克蛋白HSP家族作為高度保守的蛋白質，在魚類生長發育、蛋白合成、抗應激以及參與機體免疫等方面發揮著重要的分子伴侶作用。HSP對溫度具有高度敏感性，該基因的表達與魚類耐熱性成正相關，同時熱休克蛋白也是分析魚類耐熱性的重要分子標記[18]。而hsp70在熱休克蛋白家族中扮演重要角色，幾乎所有細胞的蛋白質生成和消亡均有其參與，因而在該家族中具有十分重要的地位，hsp70在很大程度上可以作為有效評估魚類熱應激反應的生物標志物，是魚類溫度應激中最關鍵的生理生化指標之一。

迄今為止已有多種魚類的hsp70基因的表達被廣泛研究，該基因不僅能夠提高細胞的應激耐受性，還能增加機體的抗氧化作用。田照輝等[19]研究發現，對西伯利亞鱘進行急性熱應激，其腦、鰓、脾三個組織中的hsp70mRNA表達均有不同程度的上調，其中鰓組織反應最快，表現出明顯的組織特異性;林亞秋[20]在鯉的鰓、腸、心臟、鰾、黏液、性腺等組織中檢測到hsp70基因的組織表達差異，在熱應激誘導2h后誘導hsp70基因大量表達，隨后表達量逐步降低，但在大量的研究中發現這種上升表現為短期的上升。明建華等[21]對團頭魴進行34℃的持續熱應激，發現其肝臟hsp70mRNA的變化呈現先升后降的趨勢，相對表達量的最大值在應激6h后出現，且下降后仍然高于應激前的水平;周朝偉等[22]在32℃條件下對銀鯽進行熱應激，發現其肝臟hsp70mRNA的表達量現先上升后下降的趨勢，這與團頭魴的該基因在熱應激下變化一致。強俊等[23]在31℃和35℃條件下對尼羅羅非魚進行熱應激，其肝臟hsp70mRNA的表達量也呈現先升后降;蘇嶺等[24]將鯽的水環境條件從18℃直接轉為28℃，觀察到其肝臟hsp70mRNA表達開始上升，經過4h達到最高峰后開始逐漸下降;對虹鱒RTG-2細胞進行28℃的持續應激，發現兩種hsp70基因的表達量均呈現先升后降的趨勢，相對表達量在應激3h后達到最大值[25]（圖1）。

綜上所述，在熱應激狀態下，機體的hsp70基因被激活，hsp70基因的啟動子也在轉錄調控因子的調節下被RNA聚合酶激活，致使細胞中hsp70mRNA含量升高，hsp70蛋白合成增多，最終導致hsp70的表達水平升高。此外，熱應激相關途徑能夠調節魚類hsp70基因的表達，hsp70作為“分子伴侶”，能夠結合變性蛋白對中間產物進行折疊和裝配，多數種類在熱應激前期該基因表達明顯上升，可使細胞本身提高對外界不利刺激的耐受性進而提高成活率，減少或消除對機體的損害，對機體起到促進修復的作用[26];而后期該基因獲得對高溫的耐受力，應激狀態得以緩解，使其表達下降，從而保證機體內部功能不受損傷。

2.2魚類caspase-3基因

多細胞生物調節自身生長、發育和免疫反應的基本生物學進程即為細胞凋亡。作為細胞凋亡過程中的關鍵酶——caspase家族，也是直接導致凋亡細胞解體的蛋白酶系統，在細胞凋亡過程中發揮極其重要的作用。caspase蛋白酶是一類以半胱氨基酸為活性中心的蛋白酶，具有天冬氨酸特異性，caspase家族一般分為兩類，即起始caspase和效應caspase，其中，caspase-3介導的信號傳遞途徑存在于絕大多數的細胞凋亡反應過程中[27]。

近年來，有關caspase-3基因在高溫脅迫下的表達分析已在部分魚類中得到研究，孫盛明等[28]對團頭魴進行高溫脅迫，發現熱應激能夠激活團頭魴幼魚體內的caspase-3基因，使其表達量上升;陸建等[29]探究高溫對大口黑鱸凋亡相關基因的表達，發現在37℃高溫脅迫條件下，該基因隨脅迫時間的延長呈現先升后降的趨勢;Yabu等[30]研究了斑馬魚胚胎在高溫39℃熱應激下的發育情況，結果顯示，斑馬魚胚胎出現了大量的細胞凋亡現象，caspase-3基因的表達量明顯上升，其活性也數倍增加;同樣，類似的情況也在大西洋鮭魚[31]和日本牙鲆[32]中發現。

研究魚類體內caspase-3基因在熱應激下的表達變化，結果表明短期的急性升溫會導致細胞的細胞膜和蛋白質因應激而受到損傷，使凋亡相關系列基因被激活，最后誘導細胞發生凋亡，并使機體發生細胞凋亡級聯反應，對受損傷細胞進行清除，進而維持機體內環境的穩定，也表明caspase-3基因在細胞凋亡信號的誘導、轉導和放大中起著關鍵作用。

3結語

hsp70作為細胞內最重要的分子伴侶之一，其功能在多方面均有重要應用，如蛋白質合成、跨膜運輸、精準折疊、降解、裝配、細胞骨架及核骨架穩定等[33]。除此之外，對魚類hsp70功能和在各種應激狀態下的表達情況進行研究，也有利于發掘hsp70在抗逆抗病中的更多作用。

caspase屬于細胞內大量分布的半胱氨酸蛋白酶家族，在細胞免疫過程中具有不可忽視的作用，它主要是通過將細胞外信號傳遞到細胞內從而引發細胞凋亡。研究發現，細胞凋亡相關的caspase基因在魚類各組織中廣泛表達，在參與機體的組織分化、器官系統發育、調節和維持自穩態等方面起到重要作用。作為效應凋亡基因的一種，caspase-3基因參與細胞凋亡信號的執行階段，并且該基因會被機體內在和外在的凋亡路徑激活，表明其在細胞凋亡通路上的執行階段也發揮關鍵作用，但目前有關高溫應激對該基因的表達影響研究較少，因此未來有必要更多地研究該基因在高溫脅迫下機體內部的變化及對機體的調控過程。

本文整合了不同魚類的熱耐受性指標，從而對這些魚類的耐熱能力進行初步的判斷，并對不同魚類在熱應激下hsp70基因以及caspase-3凋亡基因的表達變化進行了綜述，對高溫脅迫下不同魚類對環境變化做出的應答及內部調控機制進行分析，旨在為今后魚類耐高溫品種的選育和提高魚類耐高溫能力提供參考。

參考文獻：

[1]邵彥翔.石斑魚對溫度脅迫的耐受性研究[D].大連：大連海洋大學，2016.

[2]菅玉霞，潘雷，胡發文，等.溫度和鹽度對大瀧六線魚仔魚存活與生長的影響[J].漁業科學進展.2012，33（5）：24-29.

[3]KIRM，SUNARMC，ALTINDAGBC.Thermaltoleranceandpreferedtemperaturerangeofjuvenilemeagreacclimatedtofourtemperatures[J].JournalofThermalBiology，2017，65（2）：125-129.

[4]BEITINGERTL，BENNETTWA，MCCAULEYRW.TemperaturetolerancesofNorthAmericanfreshwaterfishesexposedtodynamicchangesintemperature[J].EnvironmentalBiologyofFishes，2000，58（3）：237-275.

[5]王妤，宋志明，劉鑒毅，等.點籃子魚幼魚的熱耐受特征[J].海洋漁業，2015，37（3）：253-258.

[6]CHATTERJEEN，PalAK，MANUSHSM，etal.ThermaltoleranceandoxygenconsumptionofLabeorohitaandCyprinuscarpioearlyfingerlingsacclimatedtothreedifferenttemperatures[J].JournalofThermalBiology，2004，29（6）：265-270.

[7]DALVIRS，PALAK，TIWARILR，etal.ThermaltoleranceandoxygenconsumptionratesofthecatfishHorabagrusbrachysoma（Günther）acclimatedtodifferenttemperatures[J].Aquaculture，2009，295（1-2）：116-119.

[8]張梅英，侯文禮，沙少國.梭魚幼魚熱忍受溫度的研究[J].生態學雜志，1999（2）：61-63.

[9]王云松，曹振東，付世建，等.南方鲇幼魚的熱耐受特征[J].生態學雜志，2008，27（12）;2136-2140.

[10]向祥.中華鳑鲏的熱耐受特征[J].科學咨詢（科技·管理），2015（33）：38-39.

[11]DENTL，LUTTERSCHMIDTWI.Comparativethermalphysiologyoftwosympatricsunfishes（Centrarchidae：Perciformes）withadiscussionofmicrohabitatutilization[J].JournalofThermalBiology，2003，28（1）.

[12]俞丹，沈中源，張智，等.溫度馴化對尖頭鳉熱耐受特征的影響[J].水生生物學報，2017，41（3）：538-542.

[13]姜旭陽，董雙林，劉騁躍，等.虹鱒和硬頭鱒幼魚對溫度的耐受性[J].中國海洋大學學報（自然科學版），2019，49（03）：57-62.

[14]任中華，宋駿杰，劉永葉，曹亮.遼東灣4種海洋生物的熱耐受性研究[J].漁業科學進展，2018，39（3）：1-10.

[15]南鷗.石島灣常見游泳動物的熱耐受性研究[D].中國科學院大學（中國科學院海洋研究所），2017.

[16]汪錫鈞，吳定安.幾種主要淡水魚類溫度基準值的研究[J].水產學報，1994，18（2）：93-100.

[17]崔雯婷，宋駿杰，田洪林，等.黃茅海五種常見海洋生物的熱耐受性[J].水產學報，2018，42（4）：522-533.

[18]琳璟，王國良.魚類hsp70研究進展[J].寧波大學學報（理工版），2007，20（4）：446-450.

[19]田照輝，徐紹剛，王巍，等.急性熱應激對西伯利亞鱘hsp70mRNA表達、血清皮質醇和非特異性免疫的影響[J].水生生物學報，2013，37（2）：344-350.

[20]林亞秋.鯉魚hsp70基因組織表達差異研究[J].安徽農業科學，2009，37（11）：4915-4916，5077.

[21]明建華，謝駿，劉波，等.團頭魴hsp70cDNA的克隆、序列分析以及熱應激對其mRNA表達的影響[J].中國水產科學，2009，16（5）：635-648.

[22]周朝偉，胡續雯，雷駱，等.熱應激對銀鯽生化指標和hsp70mRNA表達的影響[J].漁業科學進展，2018，39（6）：65-71.

[23]強俊，楊弘，王輝，等.急性溫度應激對吉富品系尼羅羅非魚（Oreochromisniloticus）幼魚生化指標和肝臟hsp70mRNA表達的影響[J].海洋與湖沼，2012，43（5）：943-953.

[24]蘇嶺，李紹戊，王荻，等.半定量RT-PCR方法檢測熱應激對鯽魚肝臟中hsp70mRNA含量的影響[J].華北農學報，2010，25（S1）：100-104.

[25]OJIMAN，YAMASHITAM，WATABES.QuantitativemRNAexpressionprofilingofheat-shockproteinfamiliesinrainbowtroutcells[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，2005，329（1）：51-57.

[26]KABAKOVAE，BUDAGOVAKR，BRYANTSEVAL，etal.Heatshockprotein70orheatshockprotein27overexpressedinhumanendothelialcellsduringposthypoxicreoxygenationcanprotectfromdelayedapoptosis[J].CellStress&Chaper，2003，8（4）：335-347.

[27]張碧云.溫度脅迫對貽貝的影響：血細胞變化以及caspase-3/7和p38-MAPK的反應[D].廈門：集美大學，2018.

[28]孫盛明，朱健，戈賢平，等.團頭魴（Megalobramaamblycephala）caspase-3基因克隆及其在高溫脅迫中的表達分析[J].基因組學與應用生物學，2017，36（10）：4090-4099.

[29]陸健，張佳佳，周國勤，等.急性高溫脅迫對大口黑鱸“優鱸3號”肝臟凋亡相關酶活性和基因表達的影響[J].淡水漁業，2021，51（2）：81-86.

[30]YABUT，TODORIKIS，YAMASHITAM.Stress-inducedapoptosisbyheatshock，UVandγ-rayirradiationinzebrafishembryosdetectedbyincreasedcaspaseactivityandwholemountTUNELstaining[J].FisheriesScience，2001，67（2）：333-340.

[31]TAKLEH，MCLEODA，ANDERSENO.Cloningandcharacterizationoftheexecutionercaspases3，6，7andhsp70inhyperthermicAtlanticsalmon（Salmosalar）embryos[J].CompBiochemPhysiolPartBBiochemMolecularBiol，2006，144（2）：188-198.

[32]YABUT，ISHIBASHIY，YAMASHITAM.StressinducedapoptosisinlarvalembryosofJapaneseflounder[J]FishSci，2003，69（6）：1218-1223.

[33]RICHTER-LANDBERGC，GOLDAUMO.Stressproteinsinneuralcells：functionalrolesinhealthanddisease[J].CellularandMolecularLifeSciences，2003，60（2）：337-349.

Researchprogressofheatstressongenehsp70andcaspase-3infish

ZHANGHuakun，WANGGuan，WANGXiuli

（CollegeofFisheriesandLifeScience，DalianOceanUniversity，Dalian116023，China）

Abstract：Theadaptationoffishtotemperaturevariesdependingontheirspeciesasaresultoflong-termevolutionandevolution.Inthisarticletwoheattoleranceindices-theuppercriticaltemperatureandtheinitialhighlethaltemperature，aswellasheatresistancerelatedgeneexpressionofdifferentkindsoffishweresummarized.Anditwasfoundthattheimportantfactorsaffectingthethermaltoleranceoffisharethebasalwatertemperatureandtherateoftemperatureincrease，aswellasthephysiologyandgeneticsoftheorganisms，andthenthethermaltoleranceofdifferentfishwasgrasped，genehsp70andcaspase-3apoptosis-relatedgenesthatweresignificantlydifferentiallyexpressedunderhightemperaturestresswereanalyzedanddiscussed，itwasfoundthatheatstresscausedasignificantincreaseintherateofhsp70synthesisinfishtoimprovetheirstressresistance，andalsocausedgenecaspase-3tobeactivatedandinducedapoptosis.

Keywords：fish;thermaltolerance;genehsp70;genecaspase-3

（收稿日期：2021-10-31）