血清MMP-9測定、肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測、INF-γ釋放試驗單獨和聯合檢測對肺結核的診斷效能

李曉倩，王智慧，池躍朋，王玉紅，謝蘭品，梁亞充

（河北省胸科醫院結核二科，河北 石家莊 050041）

肺結核是結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB ）感染導致的肺部炎癥性疾病，主要臨床表現為乏力、納差、盜汗、低熱、咳嗽、咳痰等，是常見的肺部感染性疾病。肺結核發病率較高，我國是結核病高負擔國家之一，每年新發結核病例數約130萬，且重癥結核病、結核病合并獲得性免疫缺陷綜合征等的發生率越來越高，進一步加大了治療難度[1-3]。有研究發現，早期結核病通過及時有效的治療，大多數可以治愈，但是大多數結核病患者確診時已出現嚴重癥狀，且結核病治療周期長[4]，患者配合差等都會導致患者病死率升高，因此，我國肺結核的防控形勢十分嚴峻，及時確診和有效治療對于肺結核的治療有重要意義[5]。目前，肺結核的診斷主要依靠痰MTB培養、臨床癥狀、影像學檢查結果，但某些肺結核患者會出現異常的全身或者呼吸系統臨床表現，極易被誤診或漏診，導致感染的傳播[6]。Xpert MTB/RIF檢測是一種MTB快速檢測技術，具有DNA自動提取功能，不僅能明確樣本中是否存在MTB的DNA，而且能明確其是否對利福平耐藥，且操作簡單、耗時短，相比于涂片鏡檢、細菌培養等傳統方法，大大縮短了啟動治療的時間[7]。基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是一類可降解的細胞外基質蛋白酶，在炎癥、腫瘤中發揮重要作用，在肺結核導致的肺損傷和肺纖維化等病理過程中扮演著重要的角色。γ-干擾素（interferon gamma，INF-γ）是由淋巴細胞分泌的細胞因子，與肺結核的發生密切相關。本研究擬探討MMP-9測定、肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測、IFN-γ釋放試驗對肺結核的診斷效能。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2019年5月—2020年5月河北省胸科醫院200例疑似肺結核患者，收集患者性別、年齡等一般資料和臨床資料，并根據檢查結果分為：（1）菌陽肺結核組62例，其中男30例、女32例，年齡（51.35±7.27）歲，病程（1.39±0.35）年；（2）菌陰肺結核組88例，其中男42例、女46例，年齡（50.87±6.84）歲，病程（1.41±0.23）年；（3）非肺結核組50例，其中男22例、女28例，年齡（50.66±6.15）歲，病程（1.42±0.20）年，包括肺炎20例、肺部感染20例、慢性阻塞性肺疾病10例。3個組性別、年齡等一般資料差異均無統計學意義（P>0.05）。本研究經河北省胸科醫院倫理委員會批準，患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

納入標準：（1）根據肺結核病診斷標準[8]，擬診為肺結核；（2）臨床資料完整；（3）自愿參與本研究，并簽署知情同意書。排除標準：（1）合并系統性紅斑狼瘡等免疫系統疾病；（2）合并心、肝、腎等重要臟器功能嚴重障礙；（3）合并精神疾病，不配合治療、檢查等；（4）入組前3個月內服用激素或免疫抑制劑。

1.3 研究方法

1.3.1 MMP-9、紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）及各種免疫活性因子檢測 采集所有患者入院當天空腹靜脈血10 mL，1 000×g離心30 min，靜置后取上清液備用。采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清MMP-9水平，試劑盒購自美國Abeam公司。采用美國Beckman Coulter公司IMMAGE 800全自動特定蛋白分析儀測定CRP。采用美國Genzyme公司Micro全自動血沉分析儀測定ESR，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗檢測血清白細胞介素（interleukin，IL）-15、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、IL-8，試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，檢測儀器為Multiakan FC酶標儀（美國ThermoFisher Scientific公司）。

1.3.2 IFN-γ釋放試驗 采集所有患者清晨空腹靜脈血4 mL，肝素抗凝，于1 h內平均分裝到N、T和P培養管中，1 mL/管，輕柔混勻后，于37 ℃恒溫培養箱中垂直放置，培養24 h，隨后1 000×g離心10 min，取上層血漿，-80 ℃保存待測。采用Multiskan FC酶標儀及北京萬泰生物藥業股份有限公司試劑盒檢測INF-γ水平，檢測波長分別為450和630 nm。INF-γ>14.0 pg/mL判斷為MTB陽性。

1.3.3 Xpert MTB/RIF檢測 留取患者的痰、肺泡灌洗液樣本，肺泡灌洗液樣本1 000×g離心10 min，吸棄上清，加入2 mL樣本處理液。痰樣本（1 mL）直接加入2 mL樣本處理液，渦旋震蕩10 s，充分混勻后，采用Xpert MTB/RIF試劑盒（美國Cepheid公司）進行檢測。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。正態分布計量資料采用±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以例或率表示，比較采用χ2檢驗；多因素分析采用Logistic回歸分析，采用四格表法評價3種方法診斷肺結核的效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3個組臨床資料比較

菌陽肺結核組、菌陰肺結核組和非肺結核組之間婚姻狀況、月收入、文化程度、是否為流動人口、戶籍等一般資料差異均無統計學意義（P>0.05）。2個肺結核組Xpert MTB/RIF陽性檢出例數（菌陽肺結核組49例、菌陰肺結核組69例）明顯高于非肺結核組（24例，χ2=16.894，P=0.000）。

2.2 3個組炎癥指標比較

菌陽肺結核組、菌陰肺結核組及非肺結核組患者IL-15、TNF-α、IL-8、CRP、ESR差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 菌陽肺結核組、菌陰肺結核組及非肺結核組炎癥指標比較

2.3 菌陽肺結核組、菌陰肺結核組及非肺結核組MMP-9和INF-γ比較

菌陽肺結核組、菌陰肺結核組及非肺結核組MMP-9、INF-γ水平依次降低，各組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3組MMP-9和INF-γ比較

2.4 菌陽肺結核組和菌陰肺結核組INF-γ和Xpert MTB/RIF檢測陽性率比較

菌陽肺結核組和菌陰肺結核組Xpert MTB/RIF檢測陽性率差異有統計學意義（P＜0.05），INF-γ差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 菌陽肺結核組、菌陰肺結核組肺結核組INF-γ、Xpert MTB/RIF檢測陽性率比較

2.5 肺結核影響因素分析

以MMP-9、INF-γ、Xpert MTB/RIF陽性為自變量，以發生肺結核為因變量，建立Logistic回歸模型，并賦值Xpert MTB/RIF檢測結果（陽性=1，陰性=0），結果顯示，MMP-9、INF-γ、Xpert MTB/RIF陽性與肺結核有關[比值比（odds ratio，OR）值分別為1.687、2.511、1.340，P值分別為0.004、0.005、0.005]。見表4。

表4 肺結核影響因素分析

2.5 MMP-9、INF-γ釋放試驗、Xpert MTB/RIF檢測診斷肺結核的價值

Xpert MTB/RIF檢測診斷肺結核的敏感性為86.7%，特異性為90.0%，準確性為87.5%；INF-γ釋放試驗診斷肺結核的敏感性為80.0%，特異性為62.0%，準確性為75.5%；MMP-9診斷肺結核的敏感性為80.7%，特異性為60.0%，準確性為75.0%；3者聯合診斷肺結核的敏感性為90.7%，特異性為78.0%，準確性為87.5%。見表5。

表5 MMP-9測定、INF-γ釋放試驗、Xpert MTB/RIF檢測診斷肺結核的效能

3 討論

肺結核是我國常見的慢性傳染性疾病之一，具有高發病率和高病死率的特點，我國每年因肺結核死亡的人數高達170萬，隨著病原菌對抗結核藥物耐藥性的進一步加強，肺結核的診治成為臨床亟待解決的難題之一[9-10]。目前，臨床常用的肺結核診斷方法有支氣管鏡、影像學檢查和MTB培養、免疫學檢測，在診斷典型肺結核時具有較高的敏感性和特異性，但是隨著耐藥菌的產生和獲得性免疫缺陷綜合征患者的不斷增多，非典型性肺結核的診斷依然面臨著嚴峻的挑戰[11]。因此，尋找敏感性高、特異性強的結核病診斷方法對疾病防控至關重要。

肺結核的高發病率與經濟水平和醫療衛生水平相關。本研究結果顯示，肺結核患者收入、文化程度、戶籍等與非肺結核患者沒有明顯差異，原因可能與本地區醫療衛生水平不斷提高，肺結核的防控工作取得了一定的成果有關。菌陽肺結核組、菌陰肺結核組及非肺結核組IL-15、TNF-α、IL-8、CRP、ESR差異無統計學意義（P>0.05）。原因可能是IL-15、TNF-α、IL-8、CRP、ESR均為非特異性炎癥因子，在感染、腫瘤等多種疾病中均會升高，對肺結核的診斷特異性較差[12]。本研究結果還顯示，說明MMP-9、INF-γ和Xpert MTB/RIF對肺結核均有一定的診斷價值。2個肺結核組Xpert MTB/RIF陽性檢出率、MMP-9和INF-γ水平明顯高于非肺結核組（P＜0.05）；Logistic回歸分析結果顯示，MMP-9、INF-γ和Xpert MTB/RIF陽性是肺結核的影響因素。

Xpert MTB/RIF檢測同時采用6種分子探針及6種分子信標，可覆蓋rpoB基因上的利福平耐藥決定區，不僅可以及時進行樣本處理和基因提取，而且可同時進行基因實時擴增和熒光檢測，集樣本前處理、DNA自動提取和實時熒光定量聚合酶鏈反應于一體，具有高特異性、高敏感性、操作簡單、方便快捷、污染風險小的優點，不僅能明確樣本中是否存在MTB的DNA，而且能明確其是否對利福平耐藥[13-14]。MMP-9是細胞外基質蛋白酶家族成員之一，主要發揮維持細胞外基質的穩定性的作用，在腫瘤、炎癥等情況下，發揮破壞基膜和溶解細胞外基質的作用。有研究發現，MMP-9在哮喘小鼠模型的支氣管上皮細胞中高表達，可通過上調血清類黏蛋白1樣蛋白3基因的表達，共同參與氣道重塑，而血管內皮生長因子信號通路可誘導大鼠模型肺纖維化[15]。有研究發現，MTB可以通過激活細胞外調節蛋白激酶信號通路，誘導MMP-9水平的升高，與胸膜纖維化和胸腔積液相關，促進了肺結核的發展[16]。INF-γ主要由T淋巴細胞分泌，肺結核患者細胞免疫紊亂，INF-γ大量分泌，對于肺結核的診斷有一定的參考價值。INF-γ釋放試驗采用模擬MTB蛋白質的多肽抗原引發細胞介導的細胞免疫反應，導致INF-γ分泌增加，進一步通過檢測INF-γ的分泌水平判斷是否存在MTB感染，是體外試驗，且不受卡介苗接種的影響，安全性較高[17]。林永通等[18]通過對240例疑似肺結核患者的研究發現，雖然Xpert MTB/RIF檢測診斷肺結核的敏感性有待提高，但特異性較高，且操作簡便，不需較高的專業技能，對肺結核診斷及利福平耐藥患者的篩查有一定的價值。廖彥等[19]發現MTB可通過激活細胞免疫促進MMP-9的高表達，血清MMP-9水平有助于MTB感染的輔助診斷，且肺結核患者MMP-9增高幅度高于肺癌和肺炎患者，對肺結核的鑒別診斷和篩查有一定的臨床意義，但是其敏感性有待提高。王浩等[20]發現INF-γ釋放試驗診斷肺結核的敏感性和特異性較高，但是檢測結果會受患者免疫功能、感染狀態、高齡等因素干擾，臨床應用價值有限。本研究發現，Xpert MTB/RIF檢測診斷肺結核的敏感性和特異性均較高，INF-γ釋放試驗和MMP-9診斷肺結核的敏感性較高，但特異性較低；而三者聯合診斷肺結核的敏感性為90.7%，特異性為78.0%。

綜上所述，MMP-9、INF-γ釋放試驗和Xpert MTB/RIF檢測單項診斷肺結核均有一定的不足，三者聯合檢測可提高診斷敏感性，有助于早期診斷肺結核，盡早采取治療措施。