幽門螺桿菌毒力基因分型與消化性潰瘍患者早期腎損傷相關性研究

延喜勝，雷 磊，王 劍

（1.榆林市第一醫院消化內科，陜西 榆林 718000；2.榆林市第一醫院檢驗科，陜西 榆林 718000）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是人類最為常見的慢性細菌感染，與胃炎、消化性潰瘍、胃癌等多種慢性胃腸道疾病有關[1]。近年來的研究結果表明，Hp感染與慢性腎臟衰竭、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）A腎病、膜性腎病等腎臟疾病密切相關[2-3]。目前，Hp感染與早期腎損傷指標的關系尚不明確，Hp不同毒力基因分型與早期腎損傷的關系及其可能存在的作用機制也鮮有報道。本研究旨在分析Hp不同毒力基因與早期腎損傷的關系及其作用機制，以期為臨床預防和早期治療Hp感染相關腎損傷提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2017年10月—2019年11月榆林市第一醫院消化性潰瘍患者504例，根據是否感染Hp分為Hp（+）組（315例）和Hp（-）組（189例）。入選標準：（1）經胃鏡和病理檢查確診為消化性潰瘍；（2）取胃竇部黏膜行快速尿素酶實驗和13C尿素呼氣試驗檢測，其中1項為陽性則為Hp（+），兩者均為陰性判定為Hp（-）；（3）年齡18～70歲；（4）臨床資料完整，依從性高。排除標準：（1）近4周內服用抗Hp藥物；（2）患有嚴重心、肺、肝、腦部疾病；（3）依從性差，臨床資料不完整；（4）有胃部手術史；（5）其他原因引起的早期腎損傷，病理檢查確定為腫瘤。早期腎損傷判定標準：尿視黃醇結合蛋白（retinol binding protein，RBP）>70 mg/L、尿α1-微球蛋白（alpha1-microglobulin，α1-MG）>12.5 mg/L、尿β2-微球蛋白（beta2-microglobulin，β2-MG）>3 mg/L、尿轉鐵蛋白（transferrin，TF）>2 mg/L中的1項或1項以上符合。另選取同期健康體檢者100名作為健康對照組，均為Hp（-），腎功能正常，胃泌素17和13C尿素呼氣試驗檢測結果均正常。

1.2 方法

1.2.1 一般資料 收集所有對象年齡、性別、體質量指數（body mass index，BMI）、消化性潰瘍病程、吸煙史、酗酒史等臨床資料。

1.2.2 實驗室指標檢測 采集所有對象空腹靜脈血5 mL，同時收集晨起中段尿10 mL。總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol LDL-C）、空腹血糖（fasting blood glucose，FPG）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒購自武漢艾美捷公司，檢測儀器為76002全自動生化分析儀（日本日立公司）。采用ADAMS A1c HA-8160全自動糖化血紅蛋白分析儀（日本愛科來株式會社）檢測糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）。采用A15全自動特定蛋白分析儀（西班牙BioSystems S.A.公司）及配套試劑檢測尿白蛋白、尿肌酐及血清尿素（urea，Urea）。尿RBP、尿β2-MG、尿α1-MG、尿TF、血清胱抑素C（cystatin C，Cys C）試劑盒購自上海景源醫療器械有限公司，檢測儀器為Mission P300特定蛋白分析儀[艾康生物技術（杭州）有限公司]。計算尿白蛋白/肌酐比值（urinary albumin creatinine ratio，UACR）。采用酶聯免疫吸附試驗檢測高敏C反應蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）、血清IgA1以及蠶豆凝集素（vicia vilosa lectin，VVL）與IgA1鉸鏈區多肽中絲氨酸或蘇氨酸結合N-乙酰氨基半乳糖的總結合力（以VVL-IgA1結合力表示），試劑盒均購自美國B&D公司。采用99m锝-二乙烯三胺五乙酸（99mtechnetium diethylene triamine penta-acetic acid，99mTC-DTPA）腎動態顯像法檢測腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）。

1.2.3 Hp基因分型檢測 采用逆轉錄聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測Hp 16S rRNA，引物由上海英駿生物科技工程有限公司設計并合成。PCR引物序列和產物長度見表1。采用Trizol試劑提取總RNA，采用Prime Script逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司）將RNA逆轉錄為cDNA，嚴格按試劑盒說明書操作，采用逆轉錄PCR檢測Hp毒力基因cagA、vacA和babA，反應條件為30 ℃ 9 min，55 ℃39 min，產物于-80 ℃冰箱中保存待用。PCR擴增體系：10×緩沖液2.5 μL，25 mmol/L MgCl2溶液1.5 μL，2.5 mmol/L dNTP溶液2 μL，0.5 μL Tag DNA聚合酶，2 μL DNA模板，上、下游引物各1.25 μL，加雙蒸水至總體積25 μL。擴增條件：94 ℃預變性3 min；92 ℃變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，共36個循環；72 ℃延伸4 min。每份樣本重復檢測3次。

表1 Hp不同毒力因子PCR引物序列和產物長度

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗，2個組之間比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數資料采用例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用多元非線性Logistic回歸分析Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷的影響因素。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估相關指標診斷Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷的價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hp（+）組、Hp（-）組及健康對照組一般資料比較

Hp（+）組RBP、α1-MG、β2-MG、TF、Cys C、hs-CRP、IgA1和VVL-IgA1結合力與Hp（-）組、健康對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。3個組之間年齡、性別、吸煙史、酗酒史、BMI、尿素、UACR、eGFR差異均無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 Hp（+）組、Hp（-）及健康對照組一般資料比較

續表2

2.2 Hp不同毒力基因表達情況

Hp（+）組cagA、vacA、ureA陽性率分別為48.57%（153/315）、64.76%（204/315）、25.08%（79/315）；HP（-）組、健康對照組cagA、vacA和ureA均為陰性。3個組Hp不同毒力基因PCR分析結果見圖1。

圖1 3個組Hp不同毒力基因電泳圖

2.3 早期腎損傷與Hp感染及毒力基因的關系

2.3.1 Hp（+）組與Hp（-）組早期腎損傷發生率比較 Hp（+）組早期腎損傷發生率為18.73%（59/315），高于Hp（-）組[7.41%（14/189）]（χ2=12.227，P=0.000）。

2.3.2 Hp（+）患者早期腎損傷組與無腎損傷組Hp毒力基因比較 早期腎損傷組cagA+vacA檢出率高于無腎損傷組（P＜0.05），cagA、vacA、ureA檢出率2個組之間差異均無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 Hp（+）患者早期腎損傷組與無腎損傷組Hp毒力基因比較

2.3.3 Hp（+）患者早期腎損傷組與無腎損傷組各項指標的比較 早期腎損傷組病程、RBP、α1-MG、β2-MG、TF、Cys C、hs-CRP、IgA1和VVL-IgA1結合力均高于無腎損傷組（P＜0.05），其他指標2個組之間差異均無統計學意義（P>0.05）。見表4。

表4 Hp（+）患者早期腎損傷組與無腎損傷組各項指標的比較

2.4 Hp（+）消化性潰瘍患者早期腎損傷影響因素分析

以Hp感染消化性潰瘍患者是否出現早期腎損傷（是為1，否為0）為自變量進行Logistic回歸分析。結果顯示，病程、Cys C、RBP、α1-MG、IgA1、VVL- IgA1結合力及cagA+vacA陽性表達是Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷的影響因素。見表5。

表5 Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷影響因素分析

2.5 各項指標診斷Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷的效能

以是否發生早期腎臟損傷為自變量（是為1，否為0），繪制ROC曲線，結果顯示，以2.20 g/L為最佳臨界值，IgA1診斷Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷的敏感性和特異性分別為76.99%和87.89%，曲線下面積為0.792（95%可信區間為0.684～0.866）；以3.48 AU/mg為最佳臨界值，VVL-IgA1結合力診斷Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷的敏感性和特異性分別為74.23%和89.43%，曲線下面積為0.773（95%可信區間為0.673～0.892）。見圖2。

圖2 IgA1、VVL-IgA1對Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷的診斷價值

2.6 Hp不同毒力基因分型患者腎功能指標和炎癥指標比較

將59例早期腎損傷患者按照不同毒力基因分型分為cagA+vacA組（30例）和非cagA+vacA組（29例）。cagA+vacA組RBP、α1-MG、Cys C、hs-CRP、VVL-IgA1結合力與非cagA+vacA組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），IgA1差異無統計學意義（P>0.05）。見表6。

表6 不同毒力基因分型組腎功能指標和炎癥指標比較

3 討論

Hp是一種定植于胃腸道的革蘭陰性微需氧細菌，已被證實是導致多種慢性胃腸道疾病的常見致病菌，除胃腸道疾病外，Hp感染還涉及心血管疾病、呼吸系統疾病、血液病、代謝功能障礙的發生、發展[4-6]。有研究結果表明，Hp感染參與了膜性腎病、IgA腎病、紫癜性腎病等多種原發性腎臟疾病的發生、發展，Hp感染患者發生終末期腎臟疾病的風險明顯高于非Hp感染患者[7]。另有研究結果表明，大多數膜性腎病患者腎小球毛細血管壁顆粒狀沉積物中出現Hp陽性反應；Hp感染與糖尿病腎臟病變也存在一定的相關性[8]。提示Hp感染與早期腎臟病變的關系較為密切。但Hp感染與早期腎損傷的關系及作用機制尚不明確。本研究結果顯示，Hp（+）消化性潰瘍患者Urea、UACR高于Hp（-）消化性潰瘍患者及健康對照者，而GFR低于Hp（-）消化性潰瘍患者及健康對照者，提示Hp感染與早期腎損傷存在一定的關系，進一步提示Hp感染可能參與了早期腎臟病變的發生、發展，也證明了盡早根除Hp感染的必要性。

盡管Hp感染與早期腎損傷之間的關系已經有諸多報道，但Hp不同毒力基因與早期腎損傷之間的關系的研究尚不多見。為此本研究將Hp（+）消化性潰瘍患者按是否出現早期腎損傷分為無腎損傷組和早期腎損傷組，結果顯示，早期腎損傷組cagA+vacA檢出率明顯高于無腎損傷組（P＜0.05），提示cagA+vacA共表達患者早期腎損傷可能更明顯。cagA和vacA作為2個獨立的致病因素在胃腸道疾病中發揮作用，cagA陽性表達可導致胃黏膜多核細胞浸潤和表皮蛻變[9]，而vacA陽性則會導致胃黏膜修復功能受損[10]。另有研究發現，cagA+vacA在胃潰瘍、慢性淺表性胃炎及胃癌患者體內的表達量均高于單一毒力因子[11]，但cagA+vacA對早期腎損傷是否較單一毒力基因更為明顯尚無足夠證據。本研究發現，cagA+vacA共表達患者早期腎損傷發生率明顯高于單一Hp毒力因子所致的早期腎損傷患者，提示cagA+vacA共表達對疾病早期腎臟組織的損傷作用更大，這些毒力因子可表達于腎臟組織，引起早期腎臟炎癥、氧化應激表達，從而導致早期腎損傷。本研究發現，cagA+vacA導致的早期腎損傷發生率可能更高，但本研究納入的樣本量不夠大，2個組之間的差異不明顯，后續將進行大樣本量的多中心研究加以證實。

有研究發現，2型糖尿病伴有微量白蛋白尿患者Hp感染率較正常白蛋白尿患者高，提示Hp感染是導致2型糖尿病患者尿白蛋白升高的原因，其機制可能是Hp產生的具有抗原性的脂多糖介導了機體免疫反應，從而誘導體內白細胞介素-1、腫瘤壞死因子-α[12]。Hp感染會導致機體產生炎癥反應，使C反應蛋白和尿白蛋白水平升高[13]。本研究發現，Hp感染患者hs-CRP、Cys C顯著高于Hp陰性患者，提示Hp感染與機體炎癥因子高表達有關，而炎癥因子的高表達可能與腎臟早期損傷有關。為了進一步研究Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷與機體免疫反應之間的關系，本研究納入了IgA1、VVL-IgA1結合力進行分析。IgA1及其免疫復合物水平在過敏性紫癜患者急性腎損傷中發揮作用，其水平越高，早期腎臟損傷越明顯，可能與IgA1半乳糖水平低下有關[14]。本研究結果顯示，Hp（+）消化性潰瘍伴早期腎損傷患者Cys C、hs-CRP、IgA1及VVL-IgA1結合力均顯著高于無腎損傷患者，提示Hp感染伴早期腎損傷與機體免疫反應有一定相關性。為了分析不同毒力基因與機體免疫反應之間的關系，本研究將59例Hp（+）伴早期腎損傷患者按cagA+vacA表達與否分為cagA+vacA組和非cagA+vacA組，結果顯示，2個組UACR、GFR、Cys C、hs-CRP、VVLIgA1結合力差異均有統計學意義（P＜0.05），cagA+vacA共表達患者機體炎癥反應更為明顯。本研究Logistic回歸分析結果顯示，cagA+vacA陽性表達、IgA1及VVL-IgA1結合力是Hp感染致早期腎損傷的影響因素（比值比值分別為1.769、2.054、2.442，95%可信區間分別為1.104～3.536、1.414～6.898、1.753～7.776）。ROC曲線分析結果顯示，IgA1及VVL-IgA1結合力對Hp感染消化性潰瘍患者早期腎損傷有一定的診斷價值，后續將進一步加大樣本量，研究其在臨床診斷中的作用。

本研究明確了Hp不同毒力基因分型與消化性潰瘍患者早期腎損傷之間的關系，但未明確Hp感染與早期腎損傷之間的關系，Hp感染患者出現高比例早期腎損傷與不同毒力基因之間的關系及作用機制尚未闡明，且cagA+vacA是否是通過機體炎癥反應導致消化性潰瘍患者早期腎損傷，需要通過基礎研究加以證實。此外，本研究未分析采用Hp根除法后患者早期腎損傷的發生情況，后續將進一步分析。

綜上所述，部分Hp感染消化性潰瘍患者會發生早期腎損傷，而cagA+vacA共表達患者早期腎損傷發生率更高，可能與炎癥反應、機體免疫應答有關。