膠體金免疫層析法快速檢測CRE碳青霉烯酶效果評價

姚鋰鳳，鄭巧平，楊 蒙，羅清瓊，陳 旭，陳福祥

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院檢驗科，上海 200011）

近年來，多重耐藥耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）的分離率快速升高[1-3]，且可以在院內(nèi)傳播[4]，給臨床抗感染治療和醫(yī)院感染控制帶來了極大挑戰(zhàn)。產(chǎn)碳青霉烯酶是CRE的主要耐藥機制[5]，碳青霉烯酶在超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的Ambler結(jié)構(gòu)分類中，涉及A類（絲氨酸酶）、B類（金屬β-內(nèi)酰胺酶）和D類[苯唑西林酶（oxaclillinase，OXA）]。目前，全球廣泛流行的是A類中的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC）[1]，B類酶中的新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（New Delhi metallo-beta-lactamase，NDM）、維羅納亞胺培南酶（Verona imipenemase，VIM）和亞胺培南酶（imipenemase，IMP）[6-7]，以及D類中的OXA酶[8]。多中心研究結(jié)果顯示，我國的CRE菌株主要產(chǎn)KPC酶和NDM酶[9]。有研究結(jié)果顯示，CRE引起的血流感染患者中，約32%在2周內(nèi)死亡[10]，而分析CRE的不同酶型可以為臨床治療提供依據(jù)[11]。早期檢測CRE并進行酶型分析，有助于指導(dǎo)臨床合理用藥，從而提高患者感染后的生存率，并控制其院內(nèi)傳播。目前，用于檢測碳青霉烯酶的方法有美國臨床實驗室標準化學(xué)會提出的標準改良Hodge試驗（modified Hodge test，MHT）、改良碳青霉烯滅活試驗（modified carbapenem inactivation method，mCIM）、乙二胺四乙酸改良碳青霉烯滅活試驗（ethylenediaminetetraacetic acid carbapenem inactivation method，eCIM）和Carba NP實驗[12]，以及在此基礎(chǔ)上衍生的Carba NP紙片檢測[13]、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、多重實時熒光定量PCR[14]和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）[15]等。然而，MHT只能鑒別產(chǎn)酶與否，mCIM和eCIM僅能區(qū)分是否是金屬酶表型，Carba NP實驗則需要昂貴的蛋白抽提液，而PCR、多重實時熒光定量PCR和MALDI-TOF MS步驟繁瑣，并需要相應(yīng)的檢測設(shè)備。膠體金免疫層析技術(shù)（gold immunochromatography assay，GICA）在過去的30年中已被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗，通過抗原與金標抗體結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物，并利用免疫層析顯色的原理進行檢測，無需復(fù)雜的操作和專用設(shè)備[16-17]。本研究以PCR為參考方法來評估GICA快速檢測CRE碳青霉烯酶的臨床應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

收集2016年1—12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院臨床分離的CRE，采用VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）進行細菌鑒定。

1.2 樣本入選標準

CRE菌株根據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心2015年公布的標準[18]進行確定：對任一碳青霉烯類不敏感的腸桿菌屬，即對多利培南、美羅培南或亞胺培南的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）≥4 mg/L，或者對厄他培南的MIC≥2 mg/L，又或者是被證實為產(chǎn)生碳青霉烯酶的腸桿菌。收集的CRE菌株保存于含30%甘油的營養(yǎng)肉湯中，置-80 ℃冰箱內(nèi)保存。菌株復(fù)蘇時挑取1環(huán)至血平板上培養(yǎng)，第2天再次挑取單個菌落純化、分離得到復(fù)蘇的菌株。

1.3 方法

1.3.1 PCR擴增碳青霉烯酶型基因 采用簡化堿裂解法提取細菌的DNA作為模板，碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaOXA和blaVIM的引物序列[19]見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，采用美國ABI公司GeneAmp 9700 PCR儀進行PCR擴增。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用上海天能公司Tanon EPS600電泳儀進行凝膠電泳后，于Tanon 3500凝膠成像儀上觀察結(jié)果。PCR擴增陽性產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結(jié)果于https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov查詢驗證為相應(yīng)基因后，作為陽性質(zhì)控，每批PCR均設(shè)置陰性、陽性對照進行質(zhì)量控制。

表1 5種主要碳青霉烯酶基因的PCR引物序列

1.3.2 GICA檢測碳青霉烯酶 按免疫顯色試劑說明書進行檢測，試劑購自北京金山川科技發(fā)展有限公司，具體操作步驟為：（1）準備1個無菌Eppendorf管，滴加10滴樣本處理液；（2）復(fù)蘇保存于-80 ℃冰箱的實驗菌株，挑取復(fù)蘇后的單個菌落再次純化、分離，用一次性細菌環(huán)蘸取純化、分離后的1個克隆菌株，并將該接種環(huán)插入含有樣本處理液的無菌Eppendorf管；（3）充分攪拌，使溶液均勻；（4）取50 μL稀釋后的樣本加至檢測卡的加樣孔處；（5）等待10 min后讀取結(jié)果。結(jié)果判讀：出現(xiàn)2個條帶（檢測條帶和對照條帶）表明檢測結(jié)果為陽性；僅出現(xiàn)1個對照條帶表明檢測結(jié)果為陰性；若對照條帶未出現(xiàn)，則說明該檢測無效，應(yīng)重新檢測。質(zhì)量控制：質(zhì)控線（C線）為內(nèi)部質(zhì)控，質(zhì)控線不顯色，結(jié)果無效。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件對進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例或率表示。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定結(jié)果

共收集到CRE菌株73株，包括64株肺炎克雷伯菌、5株陰溝腸桿菌、2株大腸埃希菌、1株產(chǎn)酸克雷伯菌、1株弗勞地枸櫞酸桿菌。

2.2 酶型基因PCR檢測結(jié)果

73株CRE經(jīng)酶型基因PCR分析，檢出51株blaKPC陽性、19株blaNDM陽性、2株blaIMP陽性菌、1株blaVIM陽性菌株，未檢出blaOXA陽性菌株。PCR產(chǎn)物部分電泳結(jié)果見圖1。

圖1 部分PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 GICA檢測結(jié)果

73株CRE GICA檢測結(jié)果顯示，blaKPC陽性樣本為51例，blaNDM陽性樣本為19例，blaIMP陽性樣本為2例，blaVIM陽性樣本為1例，與酶型基因PCR檢測結(jié)果一致性為100%。部分碳青霉烯酶類型GICA檢測結(jié)果見圖2。

圖2 部分CRE菌株GICA檢測結(jié)果

2.4 GICA與酶型基因PCR鑒定結(jié)果比較

將GICA與酶型基因PCR鑒定的blaKPC、blaNDM、blaIMP和blaVIM陽性的結(jié)果進行比較，以酶型基因PCR檢測結(jié)果作為檢測碳青霉烯酶類型的參考方法，結(jié)果顯示，GICA檢測CRE產(chǎn)KPC酶、NDM酶、IMP酶及VIM酶的準確性均為100%。

3 討論

碳青霉烯類作為對超廣譜β-內(nèi)酰胺酶具有較高穩(wěn)定性的非典型β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，已經(jīng)成為治療嚴重細菌感染的主要藥物[20]，而碳青霉烯酶對其具有極高的水解活性，這使得臨床治療CRE感染面臨嚴峻挑戰(zhàn)，最終導(dǎo)致了較高的病死率[21]。我國耐藥監(jiān)測網(wǎng)2020年發(fā)布的報告顯示，肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別從2005年的3.0%和2.9%上升到了2018年的25.0%和26.3%，耐藥率上升超過8倍[22]，所以快速檢測碳青霉烯酶對早期監(jiān)測CRE并預(yù)防其傳播具有重要意義。普通PCR檢測基因是目前用于確定碳青霉烯酶酶型的金標準，但PCR檢測過程中需要菌株純化及DNA提取，平均鑒定時間約20 h，而GICA無需菌株DNA提取，挑取單個菌落后僅需10 min便可讀取結(jié)果，在檢測的時間上具有非常大的優(yōu)勢。作為一種常用的檢測方法，GICA具有快速、便捷和直觀的特點，可以通過直接讀取結(jié)果來分辨KPC、IMP、NDM、VIM和OXA 5個CRE的主要酶型，可在鑒定產(chǎn)酶的同時對菌株產(chǎn)酶類型進行分析，盡早確認臨床感染，指導(dǎo)臨床用藥。

本研究共收集到73株CRE，PCR酶型基因檢測結(jié)果為blaKPC陽性51株、blaNDM陽性19株、blaIMP陽性菌2株、blaVIM陽性菌株1株，未檢出blaOXA陽性菌株。以PCR檢測結(jié)果作為檢測碳青霉烯酶類型的參考方法，GICA檢測CRE產(chǎn)KPC酶、NDM酶、IMP酶、VIM酶的準確性均為100%。但由于GICA涉及的酶型亞型的局限性，只能檢測IMP-4，OXA-23和OXA-48型酶，對于IMP和OXA的其他亞型酶無法檢測，會造成假陰性的結(jié)果[16]。另一方面，本研究中blaIMP、blaVIM及blaOXA陽性菌株較少，具有一定的局限性，后續(xù)將擴大樣本量，進一步評估GICA的其他診斷學(xué)參數(shù)。

綜上所述，GICA不僅可以快速檢測碳青霉烯酶，還可以對酶型進行快速鑒定，步驟簡單、結(jié)果直觀，具有較好的臨床應(yīng)用前景，可作為酶型確定和耐藥監(jiān)測的重要方法，為醫(yī)院感染控制和指導(dǎo)治療提供實驗室證據(jù)。

致謝：衷心感謝上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院檢驗科微生物室王院霞老師、唐毅老師、虞中敏老師、方敏老師和孫康德老師在臨床菌種收集方面提供幫助。