紅毛五加多糖單一組分AHP-Ⅲ對巨噬細胞的免疫調節作用及其機制

許 財，郭曉曉，馬 媛，王麒超，孟愛霞，陳 永*

1濰坊醫學院生命科學與技術學院；2濰坊醫學院基礎醫學院，濰坊 261000

中藥紅毛五加皮為五加科植物紅毛五加(AcanthopanaxgiraldiiHams)的莖皮，主產于甘肅、寧夏、青海、四川等地，具有祛風濕，強筋骨，活血利水之功效[1]。紅毛五加多糖(AcanthopanaxgiraldiiHams polysaccharide)為其有效成分之一，具有抗腫瘤[2]、抗病毒[3]、保肝[4]、免疫調節[5]等藥理作用。

巨噬細胞廣泛分布于機體不同組織中，不但參與固有免疫反應和適應性免疫，而且是兩者間的“橋梁細胞”[6]，活化的巨噬細胞可吞噬外來異物或直接殺死病原體和腫瘤細胞；并可通過釋放腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、NO等相關細胞因子參與機體的免疫應答。已有研究表明，中藥多糖可以激活巨噬細胞促進TNF-α、IL-6和NO等細胞因子的釋放[7]。

本文以課題組前期從紅毛五加皮中提取到的多糖單一組分AHP-Ⅲ[8]為研究對象研究其對小鼠巨噬細胞RAW 264.7細胞的活化作用，并嘗試探討其機制。

1 試劑與儀器

1.1 材料與試劑

紅毛五加多糖AHP-Ⅲ(由課題組前期制備)；小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7，購于中國科學院細胞庫。

DMEM高糖培養基、胎牛血清(美國Gibco公司，批號分別為8119461、1618862)；Mouse IL-6 Uncoated ELISA Kit 和Mouse TNF-αELISA Kit(美國Thermo公司，批號分別為229646-005、228922-007)；總一氧化氮檢測試劑盒和CCK-8檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為0827220201019、010919190704)；TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(中國TaKaRa公司，批號：AJF2613A)；NF-κB p65 Rabbit mAb、phospho-NF-κB p65 Rabbit mAb、IKK-β(D30C6)Rabbit mAb、Phospho-IKKα/β(Ser176/180)Rabbit mAb、IκBα(L35A5)Mouse mAb、Phospho-IκBα(Ser32)Rabbit mAb(美國Cell Signaling公司，批號分別為8242、3033、8943、2697、7074、7076、4814、2859)；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器設備

HERACELL 150i 200型CO2細胞培養箱(丹麥Heto公司)；HE LaserJet 1020 plus Epoch超微量分光光度計購于(美國Bio Tek公司)；LightCycler 480 Ⅱ實時熒光定量PCR儀(羅氏公司)；Amersham lmager 600超靈敏數字發光成像儀(Cytiva公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

RAW 264.7巨噬細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養基于CO2培養箱中37 ℃ 5% CO2常規培養，每3天傳代1次，傳代比例1∶3，傳代次數不超過30代。

2.2 吞噬能力檢測

采用中性紅吞噬法[9]檢測巨噬細胞吞噬能力。將細胞按7×104個/孔，接種于96孔板，37 ℃ 5% CO2條件下培養過夜。實驗孔中加入不同濃度(25、50、100 μg/mL)AHP-Ⅲ，對照(LPS)孔中加入0.1 μg/mL LPS，空白(blank)孔加入相同體積培養基，37 ℃ 5% CO2培養24 h。每孔加入1%中性紅溶液20 μL，繼續培養2 h后，PBS洗滌3次，每孔加200 μL中性紅檢測裂解液，室溫搖床上裂解10 min，酶標儀540 nm檢測各孔吸光度值。計算吞噬率：吞噬率=(實驗組吸光度值/空白組吸光度值)×100%。

2.3 TNF-α、IL-6分泌量檢測

按“2.2”的實驗分組給藥，培養24 h后收集上清，按照Thermo公司ELISA試劑盒說明書，酶標儀測定吸光度(A450 nm)，根據標準曲線計算上清中的IL-6和TNF-α的濃度。

2.4 NO分泌量檢測(Griess法)[10]

按“2.2”的試驗分組給藥，培養24 h后收集上清(60 μL)，按照試劑說明書進行操作，與Griess試劑混合，避光反應10 min，酶標儀540 nm測定吸光度。NO濃度參考NaNO2(2～80 μmol/L)標準曲線計算。

2.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)[11]

取對數生長的RAW 264.7細胞調節濃度至7.5×105個/mL，每孔2 mL接種于6孔板中，37 ℃ 5% CO2條件下培養過夜。按“2.2”的實驗分組給藥，37 ℃ 5% CO2培養24 h。Trizon試劑提取總RNA。利用HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄成cDNA。每樣品各取1 μL的cDNA按照TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ說明書進行RT-qPCR反應，所用引物如表1所示。反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s共循環30次，73 ℃終末延伸5 min。程序運行結束后，記錄收集Ct值，采用2-△△Ct法計算各組mRNA相對表達量。

表1 RT-qPCR所用引物序列

2.6 免疫印跡實驗[12]

取對數生長的RAW 264.7細胞調節濃度至2×106個/mL，每個培養皿(d=60 mm)加入1 mL細胞懸液、4 mL 10%胎牛血清的DMEM培養基，37 ℃ 5% CO2培養過夜，按“2.2”的實驗分組給藥后繼續培養1 h。加入RIPA細胞裂解液，反復吹打細胞直至細胞完全裂解，離心收集上清，提取蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。每組各取40 μg蛋白上樣，于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白(濃縮膠電壓80 V，30 min；分離膠電壓100 V，60 min)。將分離后的蛋白轉移(100 mA，60 min)至PVDF膜。加入5%脫脂奶粉于搖床上室溫封閉1 h，再分別加入一抗抗體(體積稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日以TBST洗膜3次，每次10 min；之后加入HRP標記的二抗(體積稀釋比例為1∶1 000)，于室溫反應1 h；用TBST洗膜3次，每次10 min。按ECL試劑盒說明書進行曝光顯影。

2.7 統計學分析

實驗數據均采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。組間差異用t檢驗進行，P<0.05表示有統計學顯著性差異。

3 實驗結果

3.1 AHP-Ⅲ對RAW 264.7細胞免疫活性影響檢測

3.1.1 AHP-Ⅲ對巨噬細胞RAW 264.7吞噬能力的影響

與空白組相比，AHP-Ⅲ在實驗濃度范圍內(25～100 μg/mL)均可增強RAW 264.7細胞的吞噬能力(P<0.05)，如圖1所示。

圖1 AHP-Ⅲ對RAW 264.7細胞吞噬能力的影響Fig.1 Effect of AHP-Ⅲ on the phagocytosis of RAW 264.7 cells注：與空白組相比，*P<0.05。Note:Compared with blank group,*P<0.05.

3.1.2 AHP-Ⅲ對巨噬細胞RAW 264.7細胞因子分泌的影響

如圖2所示，與空白組相比，AHP-Ⅲ在25～100 μg/mL濃度范圍內，可顯著促進RAW 264.7細胞分泌TNF-α(P<0.05或P<0.001)，并呈劑量依賴性。同時，AHP-Ⅲ高劑量實驗組可促進RAW 264.7細胞分泌IL-6(P<0.05)。

圖2 AHP-Ⅲ對RAW 264.7細胞釋放TNF-α、IL-6的影響Fig.2 Effect of AHP-III on the release of TNF-α and IL-6 from RAW 264.7 cells注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.001。Note:Compared with blank group,*P<0.05,**P<0.001.

3.1.3 AHP-Ⅲ對RAW 264.7 NO生成的影響

如圖3所示，AHP-Ⅲ在3個不同濃度的實驗組均能顯著增加RAW 264.7細胞NO的釋放(P<0.05或P<0.001)，中、高劑量組釋放量高于低劑量組，且AHP-Ⅲ濃度為50 μg/mL時，RAW 264.7的NO釋放量最高。

圖3 HP-Ⅲ對RAW 264.7細胞釋放NO的影響Fig.3 Effect of HP-III on NO release from RAW 264.7 cells注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.001。Note:Compared with blank group,*P<0.05,**P<0.001.

3.1.4 AHP-Ⅲ對巨噬細胞RAW 264.7中TNF-α、IL-6、iNOS mRNA表達的影響

TNF-α、IL-6和iNOS基因相對表達水平的結果顯示，與空白組相比，AHP-Ⅲ的25 μg/mL濃度組TNF-α基因表達水平顯著升高(P<0.05)，50 μg/mL和100 μg/mL濃度組TNF-α基因表達水平極顯著升高(P<0.001)，如圖4A所示。如圖4B所示，AHP-Ⅲ的50 μg/mL和100 μg/mL濃度組IL-6基因表達水平顯著升高(P<0.05或P<0.001)。如圖4C所示，AHP-Ⅲ的25 μg/mL濃度組iNOS基因表達水平顯著升高(P<0.05)，50 μg/mL和100 μg/mL濃度組iNOS基因表達水平極顯著升高(P<0.001)。并且，與空白組相比AHP-Ⅲ對巨噬細胞TNF-α、IL-6和iNOS基因相對表達量的影響具有明顯的劑量依賴性。

圖4 AHP-Ⅲ對RAW 264.7細胞TNF-α、IL-6和iNOS mRNA表達水平的影響Fig.4 Effect of AHP-III on the expression levels of TNF-α,IL-6 and iNOS mRNA in RAW 264.7 cells注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.001。Note:Compared with blank group,*P<0.05,**P<0.001.

3.1.5 AHP-Ⅲ對巨噬細胞RAW 264.7 NF-κB信號通路相關蛋白表達影響的測定

如圖5所示，與空白組相比，AHP-Ⅲ實驗組中的磷酸化p65(p-p65)/p65蛋白表達水平比值升高，當AHP-Ⅲ給藥濃度為50 μg/mL時達到最高，且具有顯著性差異(P<0.05)(見圖5B)；磷酸化IKKβ(p-IKKβ)/IKKβ蛋白表達水平比值在實驗濃度范圍內上升并具有顯著性差異(P<0.001)(見圖5C)。磷酸化IκBα(p-IκBα)/IκBα蛋白表達水平在實驗濃度范圍內均高于空白組，且具有顯著性差異，但沒有劑量依賴性(見圖5D)。以上結果表明AHP-Ⅲ作用RAW 264.7細胞時，細胞內的NF-κB通路會被激活。

圖5 AHP-Ⅲ對RAW 264.7細胞NF-κB相關蛋白表達的影響Fig.5 Effect of AHP-Ⅲ on expression of NF-κB related protein in RAW 264.7 cells注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.001。Note:Compared with blank group,*P<0.05,**P<0.001.

4 討論與結論

免疫反應通過“識別”和排除抗原性異物，維持機體內環境的平衡和穩定。炎癥是由劇烈的免疫反應引起[13]，其特征是協調激活各種信號通路，調節組織細胞和血液白細胞中促炎和抗炎介質的表達；有效的炎癥反應依賴于免疫系統、血管系統和組織之間復雜的細胞和分子相互作用，可提高機體免疫調節功能，例如植物多糖等可激活巨噬細胞增強其吞噬殺傷功能，以及釋放相關的細胞因子達到免疫調節作用[14,15]。

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，在機體中發揮抵抗感染、保持自身內環境穩定以及免疫監視的作用，活化后的巨噬細胞能夠產生免疫應答和炎癥有關的生物活性分子，如NO、白介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)等。已有報道表明巨噬細胞能夠作為多糖的靶細胞，通常作為理想的細胞模型來評估多糖的免疫調節活性[16]。Liu等[17]研究發現西洋參花多糖可通過增強巨噬細胞吞噬能力以及釋放免疫因子等方面增強巨噬細胞免疫活性。另外，靈芝多糖和豬苓多糖經研究發現對巨噬細胞同樣具有激活作用[18]。

目前關于多糖生物活性的研究多針對粗多糖，其成分復雜，不便于闡明多糖作用機制[19]。課題組前期從紅毛五加粗多糖分離純化得到3個單一組分[20]，本研究在課題組前期研究的基礎上，探討紅毛五加多糖AHP-Ⅲ對小鼠巨噬細胞RAW 264.7的激活作用及機制。

巨噬細胞的吞噬作用是先天性免疫的基本防御機制，中性紅實驗表明AHP-Ⅲ可以增強RAW 264.7細胞的吞噬能力，且在實驗濃度范圍內具有顯著性差異。NO是由巨噬細胞分泌產生的一種信號分子，在機體免疫調節和炎癥反應方面起重要作用[21]，由3種NO合成酶催化產生，其中一些外來刺激如干擾素類、炎癥因子類(TNF-α、IL-6)等都可激活誘導型NO合酶(iNOS)[22,23]。IL-6和TNF-α常被用作促炎細胞因子系統激活的標志[24]，RT-qPCR和ELISA實驗表明，AHP-Ⅲ通過提高TNF-α、IL-6基因表達水平，增加該細胞因子釋放量，其中ELISA實驗中空白組TNF-α細胞因子的釋放量低于標準曲線最低閾值，釋放量較少，計算結果為0；RT-qPCR實驗表明iNOS基因表達水平隨著給藥劑量增大而升高，且與空白組相比具有顯著性差異；同時，通過Griess試驗可知，與空白組相比給藥組NO分泌量顯著增加。上述實驗結果表明AHP-Ⅲ可通過提高細胞因子基因的表達進而促進細胞因子釋放，起到免疫調節作用。

NF-κB長期以來一直被認為是一種典型的促炎信號通路，很大程度上基于促白細胞介素等促炎細胞因子和腫瘤壞死因子激活，可通過巨噬細胞介導炎癥反應[25,26]。RAW 264.7巨噬細胞受TNF-α和IL-6等炎癥因子刺激后激活NF-κB信號通路中的IKK激酶，磷酸化的IKK可使IκBa磷酸化并被降解，釋放NF-κB二聚體，提高NF-κB信號通路相關蛋白磷酸化水平[27]。Western blot實驗結果表明，AHP-Ⅲ刺激RAW 264.7巨噬細胞后，NF-κB中的p65、IKKβ和IκBα磷酸化水平明顯升高。證實AHP-Ⅲ可能通過誘導NF-κB中p65和IKKβ磷酸化來激活NF-κB信號通路，進而刺激RAW 264.7巨噬細胞活化。

綜上所述，AHP-Ⅲ試驗組相較于空白組RAW 264.7巨噬細胞吞噬能力顯著提升，細胞因子NO、IL-6和TNF-α釋放量和基因表達水平明顯上調，且具有一定的劑量依賴性；同時NF-κB信號通路中的p65、IKKβ磷酸化水平明顯提高。由此可知AHP-Ⅲ可能通過激活NF-κB信號通路達到免疫調節作用，為紅毛五加多糖的進一步開發利用提供理論依據。