白術配伍人參前后揮發油調控慢性萎縮性胃炎大鼠AQP 3、4表達的比較研究

夏 佳，楊 雨，張世洋，萬 彥，吳姣姣，許金鳳，唐 飛，敖 慧

成都中醫藥大學藥學院，成都 611137

配伍是中藥臨床給藥的主要特點之一。通過合理配伍和適當煎煮，中藥飲片的物質基礎將發生一定程度的變化，從而達到增效減毒的目的[1]。其具體機制可通過經典藥對有效部位或有效部位群配伍前后物質基礎和生物活性的變化加以科學闡釋。

傳統中醫認為，慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)的基本病機為脾胃氣虛[2]。臨床常治以健脾益氣藥物。單一藥物療效往往并不理想，多以相須藥對配伍而協同增效。人參白術是臨床治療脾胃虛證的主要藥對[3]，白術健脾益氣、燥濕利水，配伍補脾益氣、養陰生津的人參，潤燥相濟，相須為用。研究發現，以人參白術為主要藥物組成的方劑能顯著治療慢性萎縮性胃炎，如四君子湯[4]和桂枝人參湯[5]，兩方中兩藥均以1∶1等量配伍。白術揮發油是白術的主要活性成分，有促進胃腸運動、抗炎、抗腫瘤等作用[6,7]。但是否可作為治療慢性萎縮性胃炎的物質基礎目前仍未可知。

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)與機體的水液代謝調節相關。據報道，AQP 3、AQP 4的表達減弱會導致體內水分丟失，加重CAG胃黏膜腺體萎縮程度[8]。由此可見，AQP 3、AQP 4的表達異常可能是脾失運化水液的分子生物學基礎，也可能是CAG的產生機制之一[9]。故白術揮發油配伍人參前后是否通過上調AQP 3、AQP 4表達來達到治療慢性萎縮性胃炎及增效的目的亦有待研究證實。

基于此，本實驗采用氣質聯用技術、電鏡技術和免疫組化技術比較研究白術與人參配伍前后揮發油成分的物質基礎和生物活性(顯微結構、超微結構和AQP 3、AQP 4表達)的影響，揭示中藥合理配伍的科學內涵。

1 材料

1.1 主要試驗藥物與試劑

白術干燥根莖和人參干燥根：購于成都國際商貿城中藥材市場，已由成都中醫藥大學陳璐副教授鑒定并確認。1-甲基-3-硝基-1-亞硝基-胍(MNNG)(批號：NH8JH-DR,東京化成工業株式會社)；兔抗鼠Aquaporin3(AQP3)、Aquaporin4(AQP4)多克隆抗體(批號：AB5300211、HPA015784)(美國Abcam公司)；DAB顯色試劑盒(批號：AR1022,武漢博士德生物工程有限公司)；山羊抗鼠IgG二抗(批號：170725,賽默飛世爾科技公司)；正己烷(批號：2015111701)、羧甲基纖維素鈉(批號：2014033101)和無水硫酸鈉(批號：2015051801)均購自成都市科龍化工試劑廠。

1.2 動物

SPF級SD大鼠(180 g～220 g)，雌雄各半，四川省中醫藥科學院研究所提供，生產許可證號：SCXK(川)2013-15。

1.3 主要儀器與設備

BX53顯微鏡和CCD DP73顯微鏡成像系統(日本奧利巴斯公司)；E-1045離子濺射裝置(日本株式會社日立高新技術事務所)；Inspect掃描電子顯微鏡(美國FEI)；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀及GC-MSD工作站(美國安捷倫科技公司)。

2 方法

2.1 揮發油的提取與制備

在水蒸氣蒸餾提取器中分別放入900 g白術粉末及白術人參(比例1∶1，各900 g)混合粉末，摻入8倍水量搖勻，置于電熱套中煎煮8 h，整個過程保持微沸狀態，至不再出油后，分離揮發油，回收上層油狀物，多余水分加入適量的無水硫酸鈉去除，最后分別采集白術揮發油和配伍后揮發油，密封后存于4 ℃冰箱，記錄揮發油的提取量。

2.2 GC-MS分析

2.2.1 供試品溶液的制備

分別向1 mL正己烷中加入20 μL上述揮發油，通過微孔膜過濾后，將其置于氣體樣品瓶中，作為氣相色譜-質譜法(GC-MS)的樣品。

2.2.2 色譜質譜條件

HP-5-MS型號毛細管質譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；以高純氦氣作為載氣，體積流量每分鐘1 mL；離子源溫度230 ℃；采用程序升溫法，將初始溫度設定為到100 ℃，以3 ℃每分鐘將溫度升高至120 ℃，并保持20 min，再以3 ℃每分鐘將溫度升高至220 ℃；以分流比1∶20進樣；注入量1 μL；全掃描模式掃描；電離方式EI，電子能量70 eV。

2.3 CAG模型制備、分組及給藥

將SD大鼠分為4組，分別為空白組、模型組、白術揮發油組(RAM)及白術人參配伍揮發油組(RAM-GRR)，每組8只。其中模型組與各藥物組皆用1-甲基-3-硝基-1-亞硝基-胍(MNNG)建立CAG模型[10]，使用含濃度為166.67 mg/L MNNG的蒸餾水代替大鼠日常飲用水，自由飲食70天。造模結束前隨機抽取模型組大鼠，進行胃黏膜病變形態學檢查，確認造模成功。白術揮發油和配伍后揮發油用含0.1%羧甲基纖維素鈉的蒸餾水配制成生藥量為0.15 g/mL的溶液備用(根據四君子湯中白術與人參(1∶1)各9 g的劑量，換算為動物給藥劑量配置)。白術揮發油組給予配伍前揮發油20.1 mg/kg灌胃，配伍后揮發油組給予配伍后揮發油22.5 mg/kg灌胃，給藥體積為10 mL/kg，每日1次，持續60日，給藥最后一日，用10%水合氯醛麻醉大鼠，快速剖取胃組織，部分放入10%甲醛溶液固定，用于HE染色和免疫組化，部分放入4-戊二醛固定，用于電鏡觀察。

2.4 胃黏膜組織病理學檢查

取出用10%甲醛溶液固定的胃組織，石蠟包埋切片。HE染色后，使用顯微鏡觀察切片并評分。評分等級以我國制定的標準與悉尼系統直觀模擬評分法并用而定[11,12]。按炎癥細胞侵襲和散布程度劃分：炎癥細胞彌漫侵襲，多面積腫大隆起，計為4分；呈灶性分布的炎癥細胞大量侵襲，計為3分；固有膜以下2/3部位被炎細胞多灶性侵襲，計為2分；固有膜淺層少量炎細胞(以漿細胞和淋巴細胞為主)侵襲，計為1分；未見或偶見炎細胞，計為0分。以黏膜固有層及腺體萎縮程度作為評分標準：胃竇部和大小彎原有腺體大面積或完全萎縮，黏膜變薄明顯(重度)，計為4分；胃竇部2/3腺體萎縮和數量減少，大小彎腺體也部分萎縮(中度)，計為3分；胃竇部表層腺體小面積萎縮和數量減少，計為2分；少量胃竇部淺表腺體細胞體積縮小，計為1分；腺體緊密排列，未見萎縮，計為0分。病理學炎性評分結果為兩者得分之和。

2.5 胃黏膜掃描電鏡檢查

磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌胃組織，5 min/次，共2次，用蔗糖溶液沖洗5 min，再用一系列梯度乙醇(30%、50%、70%、90%、100%)脫水，10 min/梯度。將組織樣品輕貼于導電粘合劑上，臨界點干燥，真空噴鍍，電鏡下進行觀察。

2.6 免疫組織化學染色分析

將10%甲醛溶液處理的胃組織石蠟包埋切片(5 μm)進行脫蠟；放于枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復，后用PBS洗滌，加入3%的H2O2去除內源性過氧化氫酶活性，再用山羊血清進行15 min的封閉；甩干封閉液，孵育一抗，4 ℃過夜，復用PBS洗滌，干燥后滴加二抗，處于室溫孵育1 h，DBA顯色，雙蒸水沖洗，終止顯色反應，用蘇木精復染，鹽酸酒精分化，脫水，干燥，封片，顯微鏡觀察目標蛋白表達并采集圖像。使用半定量法評分，每張切片通過高倍鏡觀察并隨機選取10個視野，每個視野記錄100個細胞，最后再結合陽性細胞占比和顯色程度進行判定[13]：①以陽性細胞在同類細胞中的百分占比評分：占比75%以上，4分；處于50%至75%之間，3分；處于10%至50%之間，2分；占比10%以內，1分；無占比，0分。②根據細胞染色強度評分：色深棕—3分；色棕黃—2分；色淺黃—1分；不顯色—0分。兩者乘積為目標蛋白表達強度。

2.7 統計方法

3 結果

3.1 揮發油提取量

白術揮發油與配伍后揮發油的提取量分別為12.06 mL和13.50 mL，配伍后揮發油提取量升高。

3.2 GC-MS測定結果

白術揮發油和配伍后揮發油總離子流圖可見圖1。經NIST14質譜數據系統搜索和人工分析，各組分的相對比例采用峰面積歸一化方法確定，詳見表1。

圖1 白術配伍人參前后揮發油總離子流圖Fig.1 The volatile oil of RAM before and after compatible with GRR total ion current diagram注：1：白術揮發油；2：配伍后揮發油。Note:1:RAM volatile oil;2:RAM-GRR volatile oil.

由表1可見，蒼術酮是白術配伍人參前后揮發油中相對含量最高成分，在白術揮發油中占比51.67%，而在配伍后揮發油中占比45.94%，經配伍后蒼術酮相對含量降低。除蒼術酮外，烯類化合物是共煎煮前后揮發油中相對含量和種類均較大的一類成分。其中，人參炔醇(1.01%)、α-古蕓烯(0.76%)、β-人參烯(0.61%)、異長葉烯(0.59%)、雙環吉馬烯(0.59%)和(E)-β-金合歡烯(0.39%)等是配伍后人參揮發油的少量加入成分。與白術揮發油相對比，配伍后揮發油中茴香腦和γ-欖香烯相對含量升高，蒼術酮、桉葉烷-3,7(11)-二烯、二十一烷、二十二烷的相對含量降低，其中蒼術酮成分相對含量差異量最大。

表1 白術配伍人參前后主要揮發油成分的變化

續表1(Continued Tab.1)

3.3 胃黏膜層組織病理學變化

如圖2所示，空白對照組大鼠胃黏膜層無變薄現象，其上腺管排列整齊緊密，胃腺體中主壁細胞界限分明，沒有或偶見炎細胞，且無壞死或水腫現象(見圖2A)。模型組大鼠在未給藥處理狀態下，表現出嚴重的胃黏膜萎縮和炎癥(見圖2B)。具體表現為黏膜層變薄，黏膜固有層原有腺體數量減少或部分完全萎縮，代之以化生腺體；黏膜下層壁細胞及主細胞數量大量降低，間質成分相對增多，出現壞死及水腫，以淋巴細胞和漿細胞為主的炎細胞在胃黏膜大面積侵襲。與模型組相比，各藥物組均使病理結果得到緩解，具體表現為胃黏膜固有層中腺體變形數量減少以及炎細胞浸潤降低(見圖2C、2D)，且以配伍揮發油組表現最佳。

圖2 各組大鼠胃組織病理學變化(HE，40×)Fig.2 Pathological changes of rat stomach in each group (HE,40×)注：A：空白組；B：模型組；C：白術揮發油組；D：配伍揮發油組。黑色箭頭：黏膜層變薄；黃色箭頭：黏膜固有層腺體萎縮；紅圈：炎癥因子及壞死分泌物。Note:A:Blank group;B:Model group;C:RAM volatile oil group;D:RAM-GRR volatile oil group.Black arrow:Mucosa becomes thinner;Yellow arrow:Atrophy of lamina propria glands;Red ring:Inflammatory factors and necrotic secretions.

慢性萎縮性胃炎病理評分結果如表2所示，模型組病理評分顯著高于空白組(P<0.05)；各藥物組病理評分均顯著低于模型組(P<0.05)，且配伍揮發油組較白術揮發油組可能具有下降趨勢。表明配伍前后揮發油可顯著改善大鼠慢性萎縮性胃炎的病理狀況，且配伍后揮發油的療效較配伍前有一定提高趨勢。

表2 各組大鼠慢性萎縮性胃炎病理學炎性評分

3.4 胃掃描電鏡觀察

電鏡掃描結果如圖3所示，正常組大鼠胃黏膜呈現出大量網狀胃小區，由交叉縱橫的小溝分隔而出，胃小凹大小均勻，其壁上附有類圓形且排列規則的上皮細胞(見圖3A)。模型組大鼠胃黏膜折疊隆起，腺細胞表面不平滑，腺腔間黏膜增厚，且伴有局部黏膜剝脫現象，胃小凹開口變形顯著，大小不等，小凹壁上皮細胞萎縮，細胞表面大多破潰且糜爛(見圖3B)。與模型組相比，各藥物組大鼠胃黏膜細胞萎縮程度減輕，胃小凹形狀和大小趨向規整，少量細胞破潰(見圖3C、3D)。配伍揮發油組較白術揮發油組相比，萎縮程度較輕，上皮偶見脫落(見圖3D)。

圖3 大鼠胃黏膜掃描電鏡觀察結果(2 000×)Fig.3 Scanning electron microscope observation results of rat gastric mucosa (2 000×)注：A：空白組；B：模型組；C：白術揮發油組；D：配伍揮發油組。綠色箭頭：胃小凹大小不等；紅圈：上皮細胞破潰糜爛。Note:A:Blank group;B:Model group;C:RAM volatile oil group;D:RAM-GRR volatile oil group.Green arrow:Gastric pits vary in size;Red ring:Epithelial cells broken erosion.

3.5 白術配伍人參前后揮發油成分對AQP 3、AQP 4表達的影響

結果如圖4所示，空白組大鼠胃黏膜中AQP 3、AQP 4的表達顯著高于模型組(P<0.05)。相較于模型組，白術揮發油組中僅AQP 4的表達顯著升高(P<0.05)；配伍揮發油組中AQP 3、AQP 4的表達均明顯升高且具有統計學意義(P<0.05)。與白術揮發油組相比，配伍揮發油組AQP 3、AQP 4的表達可能具有升高趨勢。結果表明白術配伍人參前后揮發油均可提高慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜AQP 4的表達，且配伍后揮發油還顯著提高AQP 3表達，可見配伍后揮發油對AQPs的總體增強效果優于白術揮發油。

圖4 各組大鼠胃黏膜AQP 3、AQP 4蛋白免疫組化(100×)及表達評分Fig.4 Immunohistochemistry (100×) and expression of AQP 3 and AQP 4 protein in gastric mucosa of rats in each group注：AQP 3：A、B、C、D；AQP 4：E、F、G、H；A、E：空白組；B、F：模型組；C、G：白術揮發油組；D、H：配伍揮發油組。與模型組相比，*P < 0.05;**P < 0.01；與白術揮發油組相比，#P < 0.05。Note:AQP 3:A,B,C,D;AQP 4:E,F,G,H;A,E:Blank group;B,F:Model group;C,G:RAM volatile oil group;D,H:RAM-GRR volatile oil group.Compared with model group,*P < 0.05;**P < 0.01;Compared with RAM volatile oil group,#P < 0.05.

4 討論

CAG是多因素引起的慢性消化系統疾病，其發展為胃癌的風險極大[14]。在全球癌癥統計數據中，胃癌的發病率和相關死亡率均位居前五[15]。因此，對CAG的診治是預防胃癌發生發展的重要手段之一。中醫認為，脾胃氣虛是CAG的常見病機[2]，臨床常以健脾益氣的藥物相濟治療[16]。經典藥對白術人參潤燥相濟，健脾益氣，常相須配伍治療CAG，臨床療效顯著[4,5]。白術揮發油是參術藥對的主要藥效成分，故本研究比較白術配伍人參前后揮發油成分的物質基礎和生物活性變化，探究兩藥配伍治療CAG的增效機制。

就揮發油提取量而言，配伍后揮發油提取量僅多于配伍前揮發油1.44 mL，這既可能是配伍導致白術揮發油含量增加的表現，也可能是人參揮發油少量加入或是新成分產生的結果。為探究其物質基礎變化原因，對配伍前后揮發油進行了GC-MS測定。與既往研究[17]類似的是，人參所含揮發油量極少，難以單獨提取和測定。故本實驗以白術揮發油和配伍后揮發油作為研究對象進行了測定和對比。測定結果顯示，白術揮發油成分主要包含蒼術酮、桉葉烷-3，7(11)-二烯、二十一烷、二十二烷等，其中蒼術酮含量占比最多，高達51.67%。與人參配伍后，蒼術酮的相對含量降低至45.94%，并有人參揮發油成分(人參炔醇1.01%、β-人參烯0.61%、α-古蕓烯0.76%、異長葉烯0.59%和(E)-β-金合歡烯0.39%等)的少量加入[18,19]，表明白術經配伍后，其活性成分的組成會因含量的增減或新成分的增加而不盡相同。配伍過程中，新成分的加入以及因煎煮溫度、水分、含氧量等外在因素的影響而發生的物理或化學反應，可能是一定程度改變藥效物質基礎的重要原因[20]。目前普遍認為中藥配伍后多組分通過多靶點、多通路，對病機進行干預和改善，可達到協同增效的目的。前期研究發現，參術配伍可通過增加皂苷含量及新成分的生成提升CAG療效[21]，說明參術皂苷成分的變化有助于藥效的增強，證實了配伍有助于中藥多組分協同增效的觀點。另外，揮發油成分也是參術藥對的重要藥效成分。有研究表明，白術與人參以1∶1和1∶2比例配伍后揮發油較白術揮發油具有更強的抗菌活性[22]。由此推測，白術配伍人參后揮發油可能由于化學組成改變使其治療CAG的活性發生改變。但尚需動物實驗給予證實。

動物實驗病理研究結果顯示，相較模型組，各藥物組胃黏膜腺體變形數量減少，萎縮程度明顯減輕，胃小凹形狀大小趨于規整，炎細胞浸潤面積顯著減小，胃組織病理評分亦顯著降低(P<0.05)，且配伍后揮發油組病理評分較白術揮發油組有下降的趨勢。以上結果說明白術與人參配伍前后揮發油均呈現出較好的胃黏膜改善效果，且參術藥對配伍后的療效較配伍前有一定提高趨勢。究其原因，前有研究[8]表示，胃黏膜腺體萎縮是CAG的主要病理特點，由于炎癥細胞(單核細胞和中性粒細胞為主)對胃黏膜的浸潤和跨膜遷移加強細胞的通透性，導致水分流失引起。AQPs與機體內水液平衡的調節密切相關，其中AQP 3、AQP 4在正常胃腸道組織中高表達，而在慢性萎縮性胃炎患者胃黏膜中低表達，這可能是胃黏膜水分丟失導致[9]。本實驗免疫組化結果顯示，與模型組相比較，白術揮發油組具有增強胃黏膜AQP 3表達的趨勢，且顯著提升AQP 4的表達(P<0.05)；配伍揮發油組胃黏膜AQP 3、AQP 4的表達均顯著提高(P<0.05)。由此可見，配伍后揮發油能增強AQP 3、AQP 4的表達，阻止水分從組織間隙到細胞內的減少，改善機體水液代謝的失調，并緩解CAG胃黏膜細胞萎縮等病理表現，說明AQP 3和AQP 4的表達失調既可以作為CAG發病機制之一，也可能成為CAG防治的靶點之一。結合物質基礎研究結果，白術-人參配伍可能通過影響揮發油物質基礎和水液代謝，從而增強健脾潤燥功效，達到增強治療慢性萎縮性胃炎療效的目的。這一結果為闡明中藥合理配伍的科學內涵提供了科學依據。

綜上所述，白術揮發油可緩解慢性萎縮性胃炎大鼠的胃組織病理情況，與人參配伍后作用增強，其機制可能與蒼術酮含量占比的降低、人參揮發油的少量加入及水通道蛋白AQP 3、AQP 4的表達增強有關。該研究結果從物質基礎和藥效機制層面闡明了參術藥對配伍增效的科學內涵，為臨床合理應用提供了依據，亦為類似相關中藥配伍研究提供了參考。