基于UPLC-Q-TOF-MS/MS的裸花紫珠水提物化學(xué)成分分析

徐萌伶，王云云，郁 萌，侯文成，劉洋洋

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所海南分所 海南省南藥資源保護與開發(fā)重點實驗室，海口 570311

裸花紫珠藥材為馬鞭草科紫珠屬植物裸花紫珠(CallicarpanudifloraHook. et Arn)的干燥葉，又名趕風(fēng)柴、節(jié)節(jié)紅等，藥用歷史悠久，具有消炎，解腫毒，化濕濁，止血等功效，主治細菌性感染引起炎癥腫毒，急性傳染性肝炎，外傷出血等癥[1,2]，收載于《中國藥典》 2020年版一部。裸花紫珠主要分布于我國廣東和海南以及馬來西亞等地，為海南道地藥材，海南黎族民間常以水煎煮液治療細菌感染引起的炎癥、急性傳染性肝炎、呼吸道和消化道出血等癥。

裸花紫珠的主要成分為黃酮類[2]、苯乙醇苷類[3]、環(huán)烯醚萜類[4]等。由于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)集UPLC高效的分離能力、檢測靈敏度高和質(zhì)譜豐富的結(jié)構(gòu)信息采集優(yōu)勢為一體，可以快速高效鑒定天然藥物中的化合物，能有效避免復(fù)雜的中藥提取物樣品僅依靠保留時間定性而可靠性差的問題[5]。Li等[6]采用UPLC-Q-TOF-MS/MS從裸花紫珠不同溶劑提取物中鑒定出17個化合物[6]；Yi等[7]采用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析比較了裸花紫珠的綠葉、黃葉、枝條、種子不同部位的化學(xué)成分。已有研究主要集中于對裸花紫珠乙醇提取物進行分析，然而裸花紫珠在黎族民間常以水煎煮后服用，提示裸花紫珠水溶性成分中可能含有諸多生物活性成分。因此，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對裸花紫珠藥材水提物的化學(xué)成分進行分析鑒定，為裸花紫珠藥材水提物的化學(xué)成分及其后續(xù)的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：主要包括Acquity UPLC?I-Class系統(tǒng)，Xevo G2-XS Q-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)，自動進樣器，二元溶劑管理器(Waters公司，美國)；ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，2.2 μm)色譜柱(Waters公司，美國)；PL203千分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)。

甲醇(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)；甲酸(質(zhì)譜級，美國霍尼韋爾)；乙腈(質(zhì)譜級，美國Fisher公司)；實驗用水(Mili-Q超純水)；裸花紫珠干燥葉(批號J001190702)由海南九芝堂藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所李榕濤鑒定為馬鞭草科紫珠屬植物裸花紫珠(CallicarpanudifloraHook. et Arn)的干燥葉。

1.2 供試品溶液的配制

取自然風(fēng)干的裸花紫珠葉，粉碎，過4號篩。精密稱取5 g藥材粉末，加水75 mL，加熱回流2 h，過濾，濃縮至干。取浸膏約0.1 g，精密稱定，加10%甲醇水溶液溶解，并定容至50 mL，即得供試品溶液。

1.3 UPLC-Q-TOF-MS檢測條件

1.3.1 色譜條件

采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm× 50 mm，2.2 μm)色譜柱，流速0.25 mL/min，進樣量5 μL，柱溫30 ℃；流動相為0.1%甲酸溶液(A)-乙腈溶液(B)，梯度洗脫：0～6 min，8%→15%A；6～16 min，15%→25%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源ESI，采用正負離子模式兩種掃描方式，掃描范圍為m/z50～1 500，掃描時間為1.5 s，檢測時間16 min，低能量碰撞電壓6 V，高能量碰撞電壓20～60 V，霧化氣和干燥氣均為氮氣。

2 結(jié)果與分析

采用“1.3.1”與“1.3.2”項下的色譜和質(zhì)譜條件，對供試品溶液進樣分析，得到正、負離子模式下的總離子流圖(total ions current，TIC)，通過比較正負離子模式下主要化合物的質(zhì)荷比，分離度、響應(yīng)等因素后，選用負離子模式下總離子流圖響應(yīng)較高。因此，選用負離子模式下的總離子流圖(TIC)進行成分解析。首先根據(jù)國內(nèi)外裸花紫珠相關(guān)文獻，收集裸花紫珠中的化學(xué)成分，自行建立數(shù)據(jù)庫，與質(zhì)譜中得到的準分子離子、特征碎片離子進行比對。其次，根據(jù)裸花紫珠水提物在負離子模式下的總離子流圖獲得的準分子離子峰所提供的化合物相對分子質(zhì)量信息，選擇目標離子掃描進行二級質(zhì)譜研究，得到化合物的特征碎片離子信息，進而對裸花紫珠水提物分離出的主要峰進行分析，推測其可能存在的裂解方式，共得到37個可能的化合物。裸花紫珠水提物在正負離子模式下的總離子流圖見圖1及圖2，鑒定出化合物的名稱、準確分子離子信息見表1。

圖1 裸花紫珠水提物供試品負離子模式TIC圖Fig.1 Negative ion mode TIC of the aqueous extract from raw C.nudiflora

圖2 裸花紫珠水提物供試品正離子模式TIC圖Fig.2 Positive ion mode TIC of the aqueous extract from raw C.nudiflora

表1 裸花紫珠水提物中化學(xué)成分鑒定結(jié)果

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2.1 裸花紫珠水提物中的苯乙醇苷類化合物

裸花紫珠水提物中主要成分是苯乙醇苷類化合物，在負離子模式下，以[M-H]-的形式存在。苯乙醇苷類是以β-葡萄糖為母核，由苯乙醇和苯丙烯酸通過酯鍵或糖苷鍵連接形成的天然糖苷類化合物，苯乙醇典型碎片為m/z153，苯丙烯酸主要以咖啡酸為主，其典型的裂解碎片m/z179和m/z161。另外，葡萄糖上還會有鼠李糖基、芹菜基等取代，形成多糖苷。根據(jù)文獻參考，以其代表性成分毛蕊花糖苷和連翹脂苷為例，峰26毛蕊花糖苷在負離子模式下經(jīng)一級質(zhì)譜掃描得到其準分子離子m/z623.199 8 [M-H]-(見圖3)，脫去咖啡酰基得到m/z461.163 8的碎片離子，脫去葡萄糖基、鼠李糖基和phA得到咖啡酸碎片m/z179，進而脫去1分子水得到161.021 0的碎片離子峰，與文獻[8]對應(yīng)一致，因此鑒定該成分為毛蕊花糖苷。

圖3 毛蕊花糖苷二級質(zhì)譜Fig.3 Product ion spectrum of acteoside

峰2的分子式為C20H30O12，保留時間為1.406 min，準分子離子峰m/z461.163 8 [M-H]-，表明其極性較大，二級質(zhì)譜圖見圖4，m/z461的準分子離子峰發(fā)生中性丟失鼠李糖基的裂解反應(yīng)，得到m/z315的碎片離子，這是二羥基苯乙醇苷的母核碎片離子，該離子繼續(xù)裂解，丟失1分子葡萄糖和水m/z180，產(chǎn)生m/z135的碎片離子。由裂解途徑可知該化合物其中含有鼠李糖基和二羥基苯乙醇苷，與文獻[9]比對后，因此鑒定為連翹脂苷E。

圖4 連翹脂苷E二級質(zhì)譜Fig.4 Product ion spectrum of forsythoside E

峰23的準分子離子峰為m/z755.238 0(見圖5)，分子式為C34H44O19，可見丟失咖啡酰基m/z162后產(chǎn)生m/z593 的碎片離子，繼續(xù)發(fā)生裂解反應(yīng)，丟失鼠李糖基后產(chǎn)生m/z447的碎片離子和丟失芹菜基后產(chǎn)生的m/z461的碎片離子，丟失葡萄糖基后產(chǎn)生m/z285的碎片離子，后可見m/z161和m/z179的咖啡酰基的典型裂解碎片，比化合物連翹脂苷E多了一分子的芹菜基和一分子咖啡酰基，通過與文獻[10,11]數(shù)據(jù)比對，鑒定該化合物為連翹脂苷B。

圖5 連翹脂苷B二級質(zhì)譜Fig.5 Product ion spectrum of forsythoside B

2.2 裸花紫珠水提物中的黃酮類化合物

黃酮類化合物是裸花紫珠中的另一主要化合物，木犀草素是其基本母核。研究表明，黃酮類化合物均發(fā)生系列以C環(huán)為中心的斷裂、丟失與重排反應(yīng)黃酮類化合物，易丟失H2O、CO2等碎片離子[12]。在負離子模式下，以[M-H]-的形式存在。

峰14的分子式為C29H34O15，在化合物12的基礎(chǔ)上增加了兩個二甲氧基，在二級質(zhì)譜中可見丟失Glc之后的m/z475 [M-H-Glc]-的碎片離子(見圖6)，以及木犀草素典型碎片離子m/z285。經(jīng)過與文獻[13,14]比對，鑒定該化合物為3′,4′-二甲氧基木犀草素-7-O-新橙皮苷。

圖6 3′,4′-二甲氧基木犀草素-7-O-新橙皮苷二級質(zhì)譜Fig.6 Product ion spectrum of 3′,4′-dimethoxyluteolin-7-O-neohesperidoside

峰16在負離子模式下經(jīng)一級質(zhì)譜掃描得到準分子離子峰為m/z463.087 9 [M-H]-(見圖7)，在二級質(zhì)譜中脫去1分子Glu之后得到m/z301的碎片離子，及木犀草素典型碎片離子m/z285，根據(jù)文獻[15]比對，鑒定該化合物為6-羥基木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

圖7 6-羥基木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷二級質(zhì)譜Fig.7 Product ion spectrum of 6-hydroxyluteolin 7-O-β-D-glucoside

峰22的分子式為C21H20O11，準分子離子峰為m/z447.092 9(見圖8)，在二級質(zhì)譜中可見其加合離子m/z523.144 3 [M+HCOOH-H]-，丟失Glu后剩余的典型m/z285木犀草素的苷元碎片離子，以及木犀草素發(fā)生黃酮類經(jīng)典RDA裂解產(chǎn)生的m/z133碎片離子，通過比對文獻[16]數(shù)據(jù)，鑒定該化合物為木犀草苷。

圖8 木犀草苷二級質(zhì)譜Fig.8 Product ion spectrum of cynaroside

2.3 裸花紫珠水提物中的環(huán)烯醚萜類化合物

環(huán)烯醚萜類化合物是裸花紫珠的另一化合物，目前對該類化合物的研究發(fā)現(xiàn)，其主要集中在以梓醇為母核，連接以咖啡酰、香豆酰和阿魏酰等形成衍生物。在負離子模式下，易失去中性H2O、CO2、CH3OH等形成[M-H]-。

峰9在負離子模式下形成準分子離子峰m/z523.144 3 [M-H]-(見圖9)，二級質(zhì)譜下可見m/z361的碎片離子，在母離子m/z523.144 3的基礎(chǔ)上減少了m/z162，說明是在母離子的基礎(chǔ)上丟失了1分子的葡萄糖苷形成的梓醇的典型碎片，同時還觀察到m/z179和m/z161的咖啡酸典型碎片，通過與相關(guān)文獻[5,17]比對，鑒定該化合物是6′-O-咖啡酰梓醇。

圖9 6′-O-咖啡酰梓醇二級質(zhì)譜Fig.9 Product ion spectrum of 6′-O- caffeoylcatalpol

峰20在負離子模式下形成準分子離子峰m/z537.159 2 [M-H]-(見圖10)，二級質(zhì)譜下可見阿魏酸m/z193和阿魏酰m/z175的關(guān)鍵碎片離子，以及代表梓醇的m/z361碎片離子，通過與相關(guān)文獻[5,17]比對，鑒定該化合物是6-O-阿魏酰梓醇。

圖10 6-O-阿魏酰梓醇二級質(zhì)譜Fig.10 Product ion spectrum of 6-O-feruloylcatalpol

峰34在負離子模式下形成準分子離子峰m/z521.164 7 [M-H]-(見圖11)，二級質(zhì)譜下可見m/z297、m/z195和m/z163的關(guān)鍵碎片離子，通過與相關(guān)文獻[18]比對，鑒定該化合物是6-O-香豆酰-8-表番木鱉酸。

圖11 6-O-香豆酰-8-表番木鱉酸二級質(zhì)譜Fig.11 Product ion spectrum of 6-O-coumaroyl-8-epi-loganic acid

3 討論與結(jié)論

本研究從裸花紫珠水提物中共鑒定出37個化學(xué)成分，包括毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷和連翹酯苷B等16個苯乙醇苷類化合物，木犀草苷等5個黃酮類化合物和16個環(huán)烯醚萜類化合物。而Li等[6]從裸花紫珠水提物中僅鑒定出15個化合物。此外，本研究首次從裸花紫珠中發(fā)現(xiàn)并鑒定出京尼平苷酸、連翹脂苷E和肉蓯蓉苷F等3個化合物。

裸花紫珠水煎液在民間常用于治療細菌感染引起的炎癥、急性傳染性肝炎、呼吸道和消化道出血等癥，國內(nèi)外學(xué)者從現(xiàn)代化學(xué)與藥理研究角度已有報道。Guan等[19]發(fā)現(xiàn)木犀草苷具有較強的殺菌消炎、解熱鎮(zhèn)痛的功效，表現(xiàn)出良好的抗病毒和抗腫瘤作用；Jiang等[20]發(fā)現(xiàn)連翹酯苷B具有抗炎、抗氧化作用，從而改善心肌缺血-再灌注(I/R)模型造成的大鼠心臟功能損傷；Zhang等[21]發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷可顯著縮短活化部分凝血活酶時間(APTT)，通過影響內(nèi)源性凝血途徑發(fā)揮止血作用；Nam和Chae等[22,23]發(fā)現(xiàn)異毛蕊花糖苷具有顯著的抗炎活性和抗氧化活性，而Tang等[24]則發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷均可促進小鼠骨髓來源樹突狀細胞的增殖，表現(xiàn)出一定的神經(jīng)保護作用。可見，木犀草苷、毛蕊花糖和異毛蕊花糖苷的生物活性與裸花紫珠傳統(tǒng)功效相關(guān)，其實毛蕊花糖苷和連翹酯苷B等化合物也常作為含量測定指標用于評價裸花紫珠質(zhì)量優(yōu)劣[25]。因此，木犀草苷、毛蕊花糖和異毛蕊花糖苷可作為裸花紫珠指標性成分。

本文采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對裸花紫珠水提物中的化學(xué)成分進行鑒定，并結(jié)合其藥理活性，推測了裸花紫珠的指標性成分，可為裸花紫珠后續(xù)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及中成藥二次開發(fā)和質(zhì)量控制提供參考。