靈芝麥角硫因高通量檢測方法研究

徐晴元，游俊健，林俊芳,2，薛玲娜，余穎豪，郭麗瓊,2*

1華南農業大學食品學院生物工程系；2廣東省微生態制劑工程技術研究中心，廣州 510640

麥角硫因(ergothioneine，EGT)又名為2-硫基-L-組氨酸三甲基內鹽，是存在于很多動植物體內含量豐富的天然氨基酸[1]，僅在部分微生物(放線菌、鏈霉菌)、蕈菌、某些藍細菌中合成，不能由動物機體自身合成EGT[2]，人體只能從食物中攝入并通過高特異性的有機陽離子轉運蛋白1型(organic cation transporter novel type-1，OCTN1)[3]在各種細胞和組織中積累高濃度EGT[4]。EGT被認為是一種很強的抗氧化劑，Servillo等[5]對其抗氧化機理進行了探討，認為其擁有獨特的氧化還原機制，并提出了一種EGT在細胞中的獨特抗氧化作用。EGT的標準氧化還原電位是-0.06 V，其它硫醇的電勢一般在-0.32 V～-0.2V之間，因此EGT在生理pH環境下比其他抗氧化劑更穩定，不易自發氧化[6]。研究表明，EGT具有多種重要的生理功能，如抗炎作用[7]；通過保護DNA實現的細胞保護功能[8]；通過促進神經細胞分化作用促進神經新生達到的抗抑郁功能[9]；通過抵抗氧化應激實現的眼睛保護功能[10]；通過中斷與動脈粥樣硬化發生相關的黏附分子表達實現的心腦血管保護功能[11]；通過抑制毒性達到的對神經退行性疾病的預防和治療作用[12]等，且本身具有安全性[13,14]，因此，EGT在醫藥、食品和化妝品等行業具有廣泛的應用前景。

EGT生產方式有化學合成、食用菌提取及微生物發酵等，由于前兩者成本較高，工序復雜，因此食用菌菌絲的深層發酵是目前EGT工業化生產的主流模式[15]，但自然菌株EGT產量低，需要通過育種技術培育EGT高產工業化菌種，培育工業食用菌菌種的方法有誘變育種[16]、雜交育種[17]、基因工程育種[18]及原生質體融合育種[19]等，但每種育種方法都需要進行多次、大樣本量EGT含量檢測，需說明的是，育種過程中EGT含量檢測的意義更多在于比較樣本間含量高低。目前EGT的檢測方法有高效液相色譜法[20,21]、高效毛細管電泳法[22]和薄層電泳法[23]等。使用最為廣泛的是高效液相色譜法，該方法可以從物質復雜的體系中準確檢測出EGT的含量，但高效液相色譜法有其明顯缺陷，即需探索針對不同樣品不同的檢測條件，且由于EGT出峰時間晚，標品昂貴，在育種需從大量樣本中篩選出高產樣本的情況下會導致檢測耗時過長，成本過高，極大地阻礙了EGT的開發與應用研究，因此，急需建立一種可準確測定樣本間EGT濃度的高通量快速檢測方法。

由于EGT具有強抗氧化性，2價鐵離子還原性適中(既不會受空氣中氧氣接觸干擾，也不會因為還原性太弱導致指示性降低)，EGT能與2價鐵離子反應生成無色螯合物，同時硫氰酸根離子與二價鐵離子反應生成紅色絡合物，根據以上特點，本研究選用硫氰酸鐵為還原劑，使用麥角硫因標準品與硫氰酸鐵反應，旨在建立一種麥角硫因的高通量檢測體系。同時以不同靈芝菌株EGT產量不同對該高通量檢測體系進行驗證。本研究結果將為高產EGT微生物的篩選及高產EGT新菌株的選育提供了新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料

靈芝菌株NH8(元寶靈芝，Ganodermalucidum)、NH11(盆景3號，Ganodermalucidum)、NH12(美國大靈芝，Ganodermaresinaceum)、NH13(黑芝，Ganodermasinense)購于山東省壽光食用菌研究所； FQ16(硫因靈芝，Ganodermasessile)為野外采集并由本實驗室(華南農業大學食品學院精準營養與健康實驗室)分離純化菌株；靈芝融合子菌株RS10、RS11、RS12、RS13、RS14、RS15、RS16為本實驗室培育。

1.1.2試劑

硫氰酸鐵Fe(SCN)3(CAS登錄號4119-52-2)購自湖北廣奧生物科技有限公司。麥角硫因標準品純品購自天津諾信公司，純度99%。

1.1.3儀器

本實驗所用主要儀器如下:高效液相色譜儀LC-2030(日本，株式會社島津制作所)；酶標分析儀SAF-680T(上海巴玖實業有限公司)；冷凍干燥機FD-10-50(博醫康)；氮吹儀NAI-DCY-12Y(上海那艾儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1麥角硫因標準品配制

使用分析天平準確稱取麥角硫因標準品，使用一級水溶解并配置成5個質量濃度梯度溶液：0.022、0.011、0.005 5、0.002 7、0.002 2 mg/mL。每個質量濃度設置3個平行。

硫氰酸鐵試劑按照固液比(g/mL)0.1∶10 加入無水乙醇溶解，過膜0.22 μm，制得硫氰酸鐵溶液(現配現用)。

先加入10 μL硫氰酸鐵溶液于96孔板中，再加入100 μL麥角硫因標準品梯度溶液，吹打混合。使用酶標儀記錄吸光度，酶標儀所用波長為450 nm。

1.2.2靈芝菌絲體EGT的提取

配置PSB培養基(馬鈴薯200 g/L(煮汁)，蔗糖25 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，NH4Cl 2 g/L，自然pH)，250 mL容量三角瓶分裝100 mL，加入約20顆玻璃珠，115 ℃高壓濕熱滅菌30 min。從菌株平板上切取大小約為0.5 cm×0.5 cm的菌絲塊，接種至PSB培養基中，控制接種量為5 %，置于搖床，28 ℃，150 rpm培養4天，獲得種子液。

從種子液中吸取菌液至新的已分裝好的無玻璃珠PSB培養基中，控制接種量為5%，置于搖床，28 ℃，150 rpm培養10天，每個菌株設置3平行。

預處理大孔樹脂：稱取大孔樹脂NKA-9適量，使用無水乙醇浸泡4 h以上。使用一級水沖洗大孔樹脂至無明顯醇味，同時靜置后水呈澄清透明，抽濾收集大孔樹脂，使用1 M HCl浸泡大孔樹脂4 h以上。使用一級水沖洗大孔樹脂至沖洗液pH呈中性，抽濾收集大孔樹脂，使用1 M NaOH浸泡大孔樹脂4 h以上。使用一級水沖洗大孔樹脂至沖洗液pH呈中性，抽濾收集大孔樹脂，加入一級水，于4 ℃保存。

10天后收取菌絲，過濾以將發酵液與菌絲分離，收集菌絲用50 mL蒸餾水沖洗，將菌絲移至培養皿中，-45 ℃急速冷凍干燥36 h。稱取干燥后菌絲體0.1 g，研磨粉碎，加入一級水10 mL，300 W超聲提取10 min。提取后置于65 ℃水浴30 min，使用過濾法收集上清液4 mL，加入70 %乙醇8 mL和1 % SDS溶液2 mL，4 ℃靜置12 h。

將靜置后溶液常溫離心8 000 rpm，15 min，取上清。使用氮吹儀，85 ℃，氮吹至4 mL以下，使用一級水定容樣品至4 mL，添加1 g預處理大孔樹脂(抽濾收集)，置于搖床，30 ℃、150 rpm震蕩4 h，取1 mL樣品加入1 mL氯仿混勻，30 ℃水浴30 min，吸取上層液體至新的離心管中，加入等體積一級水進行稀釋，使用HCl調節pH至2，即為待測樣品液。

1.2.3EGT-硫氰酸鐵體系對不同靈芝菌株的測驗

選擇麥角硫因產量不同的靈芝菌株(見表1)，按“1.2.2”中的培養和提取方法獲得的待測樣品100 μL，加入已預先加入10 μL硫氰酸鐵溶液的96孔板中，靜置等待30 min，觀察顏色變化。麥角硫因含量越高的樣品，顯色越淺。在450 nm波長下檢測吸光度，麥角硫因含量越高的樣品，吸光度越小。每株靈芝菌株設置3個平行。

表1 應用于EGT-硫氰酸鐵體系的靈芝菌株

1.2.4 高效液相色譜法驗證

高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測條件：儀器使用島津LC-2030高效液相色譜儀進行麥角硫因高效液相色譜檢測，色譜柱為：Welch Ultimate HILIC Amphion II 色譜柱，檢測波長為257 nm，流動相為乙腈∶水(85∶15)，流速0.8 mL/min，進樣量為20 μL，柱溫30 ℃。麥角硫因標準曲線制作參考Hu等[24]報道方法，采用上述HPLC檢測條件進行檢測，以EGT質量濃度(mg/g)為橫坐標，HPLC檢測峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

取1 mL經“1.2.2”方法取純化后的菌絲提取液，經0.22 μm水系微孔濾膜過濾后，進行HPLC檢測，每株靈芝菌株設置3個平行。得到樣品中代表麥角硫因含量的峰面積，將峰面積代入上述麥角硫因標準曲線方程得到相應樣品中麥角硫因含量，然后通過下式換算。

EGT(mg/g DW)=C×40

式中：C代表通過麥角硫因標準曲線換算得到的麥角硫因質量濃度值(mg/mL)，EGT為每克干重菌絲中麥角硫因含量。

1.2.5 EGT-硫氰酸鐵體系應用于高產EGT靈芝新菌株的篩選

為檢驗EGT-硫氰酸鐵體系在育種實驗中的實用性，將本實驗室通過基因組重組技術獲得的靈芝融合子新菌株RS10、RS11、RS12、RS13、RS14、RS15、RS16使用EGT-硫氰酸鐵體系進行高產EGT菌株的篩選。

2 結果與分析

2.1 EGT-硫氰酸鐵體系的建立

使用不同濃度的EGT標準品溶液加入到硫氰酸鐵的溶液中，結果表明硫氰酸鐵的顯色反應與EGT的濃度呈線性依賴關系，EGT濃度越高顏色越淺，各處理濃度之間顯色差異顯著(見圖1A)。測定各樣品450 nm處的吸光值，利用GraphPad Prism軟件繪制其散點圖(見圖1B)，線性回歸方程為y=-18.40x+ 1.002，R2值為0.979 1，說明體系A450 nm值隨著樣品EGT濃度的增加而減少，趨勢穩定，因此可以推論各處理間通過A450 nm值測定判斷樣品中的EGT含量的穩定性是可行的。

圖1 不同質量濃度EGT與硫氰酸鐵反應后的吸光值A450nmFig.1 Absorbance of EGT with different contents reacted with ferric thiocyanate注：A：1～5分別為0.022、0.011、0.005 5、0.002 75、0.002 2 mg/mL EGT標準品的EGT-硫氰酸鐵反應體系；B：EGT標準品溶液濃度-體系A450 nm值線性擬合圖。Note:A:1-5 are the EGT ferric thiocyanate reaction system of 0.022,0.011,0.005 5,0.002 75,0.002 2 mg/mL EGT standard respectively.B:The linear fitting diagram of solution concentration-system A450 nm value of EGT standard.

2.2 EGT-硫氰酸鐵體系檢測不同靈芝菌株中的EGT含量

為確定EGT-硫氰酸鐵體系的實際應用的可行性，將表1中靈芝菌株按照“1.2.2”方法進行處理，按照“1.2.3”方法應用本體系進行檢測，得到表1各靈芝菌株對應的450 nm處吸光值顯著性差異圖(見圖2)，圖中顯示，除了FQ16和NH12EGT產量差異不顯著外，其余均有顯著差異，而且吸光值大小與EGT含量呈負相關。可見所測菌株A450 nm值組間存在顯著性差異(P<0.05)，組內樣本間差異較小。證明本方法可實際應用于菌株EGT濃度判斷，能靈敏明確區分菌株EGT濃度的高低，體系穩定。

圖2 EGT-硫氰酸鐵體系檢測不同靈芝菌株的EGT含量吸光值A450 nmFig.2 Detection of EGT content and absorbance of different Ganoderma spp.strains by EGT- ferric thiocyanate system注：圖中a～d為樣本間顯著性差異標識，字母不同表示樣本間P<0.05。Note:a-d are the mark of significant difference between samples,different letters indicate P < 0.05 between samples.

2.3 EGT-硫氰酸鐵體系檢測EGT含量的準確性驗證

采用高效液相色譜法驗證EGT-硫氰酸鐵體系的準確性。使用高效液相色譜儀測定不同濃度EGT標準品溶液的峰面積，繪制麥角硫因-峰面積標準曲線(見圖3)。

圖3 麥角硫因標準品HPLC檢測結果Fig.3 HPLC test results of ergothione standard注：A：EGT標準品液相色譜圖，檢測波長257 nm；B：EGT濃度(mg/mL)-峰面積標準曲線。Note:A:Liquid chromatogram of EGT standard,the detection wavelength is 257 nm B:EGT concentration (mg/mL)-peak area standard curve.

使用與標準品溶液相同的色譜條件測定實驗各靈芝菌株的EGT含量，使用GraphPad Prism繪制其峰面積值柱狀圖(見圖4)，可見菌株EGT含量由FQ16至NH8依次降低，與高通量檢測結果相符。

圖4 高效液相色譜檢測不同靈芝菌株的EGT含量Fig.4 Determination of EGT content of different Ganoderma spp.strains by high performance liquid chromatography

進一步對以上圖2和圖4的結果進行對比分析，結果見圖5，可見各靈芝菌株EGT-硫氰酸鐵體系的A450 nm值隨著EGT濃度的增加而減小，且兩種檢測方法測得各樣品EGT濃度高低趨勢一致，EGT-硫氰酸鐵體系檢測結果組內差異更小，EGT濃度相近的樣品也能通過本體系吸光值準確反映出EGT含量高低，證明本體系檢測結果正確可用，檢測體系靈敏穩定。

圖5 不同靈芝菌株EGT含量兩種檢測方法結果對比Fig.5 Comparison of the results of two detection methods for EGT contents from Ganoderma spp.strains

2.4 EGT-硫氰酸鐵體系在高產EGT靈芝新菌株篩選中的應用

將靈芝融合子新菌株分別用EGT-硫氰酸鐵體系法和高效液相色譜法檢測EGT含量，反應體系顏色與色譜結果比對(見圖6)，可見融合子菌株EGT-硫氰酸鐵反應體系顏色由深到淺依次為RS13、RS14、RS16、RS12、RS10、RS15、RS11，與色譜圖結果完全吻合，推論本體系方法適用于產EGT靈芝菌株育種過程EGT含量的檢測比較。

圖6 靈芝融合子菌株EGT含量兩種檢測方法對比Fig.6 Comparison of two methods for detecting EGT content of Ganoderma spp.fusant strain注：a：融合子RS10-RS16液相色譜圖；b：高通量體系顯色結果。Note:a:Fusant RS10-RS16 liquid chromatogram;b:Color results of high throughput system.

3 討論與結論

根據麥角硫因具有強還原性的理化性質，在構建出EGT-硫氰酸鐵體系之前，還先后實驗構建堿性高錳酸鉀體系、溴甲酚綠體系、藍瓶子亞甲基藍體系、愈創木酚體系、氯化鐵-EGT體系，結果表明：堿性高錳酸鉀體系因為穩定性低失敗；溴甲酚綠體系顯色結果因為與pH有關失敗；藍瓶子亞甲基藍體系中，由于還原態亞甲基藍的還原性太強，與空氣中的氧氣接觸也極易被氧化成亞甲基藍，導致實驗無現象而失敗；愈創木酚體系同樣因為還原性太強受氧氣接觸干擾而失敗；氯化鐵體系因為顯色程度太低而失敗。EGT-硫氰酸鐵體系可以用于EGT高通量檢測方法的研究。

EGT-硫氰酸鐵檢測體系構建過程中發現，待測樣品按照普通EGT粗提方法即醇沉-氮吹-定容提取時，提取液中殘留的酚類物質會影響體系的顯色反應，降低體系的靈敏度，因此粗提液在氮吹定容后，需增加氯仿除酚步驟。

靈芝是我國傳統名貴的藥用真菌，含有多種生物活性物質和生理功能，其麥角硫因含量在眾多食用菌中含量較高，但是作為商業化生產的菌株其產量還偏低，因此培育高產麥角硫因的靈芝新菌株具有重要的意義及實際應用價值，基于以上原因，本實驗室通過原生質體融合再生，分離鑒定得到一批擬融合子，本方法驗證過程使用的靈芝融合子，均來源于此。

本研究建立的方法基于EGT本身理化性質，檢測體系靈敏穩定，適用于產EGT工業發酵菌株選育過程中，大批量樣本的快速比較，且理論上只需經過簡單的樣品EGT提取優化，即可適用于絕大部分菌株EGT含量的高通量快速檢測，打破了原有EGT研究檢測的局限性，為EGT的整體開發應用研究提供了新的方法和思路。