基于網絡藥理學分析瑞香素抗多種腫瘤的作用機制及體外實驗驗證

馮 松，張小東，覃亞亞，彭 彬*

1川北醫學院；2川北醫學院附屬醫院，南充 637000

瑞香素提取于瑞香屬植物，為我國首創的天然藥物單體[1]，因其具有抗凝作用，目前臨床主要用于心血管疾病治療。另外，大量研究表明瑞香素對多種腫瘤細胞有抑制作用，其機制包括通過MAPK1/2-JNK1/2-Akt通路抑制乳腺癌、作用于Bcl-2/Bax靶點進而抑制肝癌、通過Akt/NF-κB通路抑制肺腺癌[2]、通過AMPK/Akt/mTOR通路抑制卵巢癌[3]，瑞香素抗腫瘤作用的靶點及通路有一定共通性。腫瘤是嚴重危害人類健康的重大疾病，其發病率逐年上升。其中肝癌是致死性最高的惡性腫瘤[4]；三陰性乳腺癌是女性乳腺癌中惡性程度較高，且治療困難的一種[5]；惡性膠質瘤是致殘、致死率均高的神經系統惡性腫瘤[6]。既往研究表明瑞香素有明確的抗多種腫瘤的作用，但其抗腫瘤作用是否存在共同的靶點或通路尚未見報道。因此，本研究擬通過網絡藥理學預測瑞香素治療惡性膠質瘤、肝癌、三陰性乳腺癌的共同靶點或通路，并對其進行體外實驗驗證，為瑞香素在抗腫瘤中的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學預測瑞香素抗膠質瘤、肝癌、乳腺癌的共同靶點及通路

通過PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查詢瑞香素(daphnetin)的二維結構，使用Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)預測瑞香素的潛在作用靶點，剔除其中可能性為“0”的靶點。

通過GeneCards(https://www.genecards.org/)數據庫中搜索“Malignant Glioma”、“Adult Hepatocellular Carcinoma”、“Triple Negative Breast Neoplasms”，分別檢索出惡性膠質瘤、肝癌和三陰性乳腺癌的靶點，去除relevance score<10的靶點。上述靶點取交集，得到三種腫瘤共同靶點。

將三種腫瘤交集靶點和瑞香素預測靶點分別輸入到Cytoscape(version 3.7.1)中，用該軟件構建瑞香素-三種腫瘤蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)圖。使用“Cyto NCA”插件，根據“degree、betweenness、closeness”數據篩選出核心靶點。

將篩選出的核心靶點導入Metascape數據庫(https://metascape.org)，對瑞香素抗腫瘤靶點進行GO及KEGG富集分析。以P< 0.01作為篩選標準。

分子對接實驗，將瑞香素三維結構導入ChemBio3D Ultra 14.0進行能量最小化，AutodockTools 1.5.6進行加氫、計算電荷、分配電荷、設置可旋轉鍵。從PDB(http://www.rcsb.org/)數據庫下載關鍵靶點蛋白，使用Pymol 2.3.0去除蛋白結晶水、原始配體等，將蛋白結構導入AutodockTools 1.5.6進行加氫、計算電荷、分配電荷、指定原子類型。采用AutoDock Vina 1.1.2進行對接。結果利用PyMOL 2.3.0和LigplotV 2.1進行相互作用模式分析。

根據人類蛋白圖譜數據庫(www.proteinatlas.org)，篩選出RRM2表達較高的細胞系。

1.2 體外實驗驗證

1.2.1 細胞、試劑與儀器

惡性膠質瘤細胞株(U-251 MG)、肝癌細胞株(HepG-2)、三陰性乳腺癌細胞株(MDA-MB231)由川北醫學院基礎醫學院創新平臺提供。瑞香素(北京索萊寶科技公司)；DMEM培養基(GIBCO公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；CCK-8試劑盒、P53、RRM2抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；羊抗兔IgG抗體(北京華興博創生物技術中心)；細胞培養箱(美國Thermo公司)；Bio-Radimark全自動酶標儀、Bio-Rad chemiDoc XRS+化學發光凝膠成像系統(美國Bio-Rad)。

1.2.2 細胞培養

上述腫瘤細胞使用含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素的培養基，在37 ℃，5% CO2培養箱中培養，于倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，取對數生長期細胞做后續實驗。

1.2.3 CCK8法檢測細胞抑制率

分別將U-251 MG、HepG-2和MDA-MB231細胞以每孔5×103細胞(100 μL懸液)接種于96孔板中，各接種15孔。于37 ℃、5% CO2下培養24 h后，每種細胞分別加入含瑞香素濃度為0(對照組)、10、20、40和80 μg/mL完全培養基100 μL，各設3復孔。于48 h后，每孔加90 μL無血清DMEM及10 μL CCK-8溶液，繼續培養2 h，后用酶標儀在450 nm波長下測定各孔吸光度，實驗重復3次。

細胞抑制率=[1-(A對照孔-A實驗孔)/(A對照孔-A空白孔)]×100%

1.2.4 Western blot檢測P53、RRM2

分別用0(對照組)、40和80 μg/mL的瑞香素處理U-251 MG、HepG-2和MDA-MB231細胞48 h后，加入適量的RIPA裂解細胞提取蛋白，BCA法蛋白定量，樣品在10% SDS-PAGE行電泳，然后電轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，P53、RRM2和GAPDH兔來源一抗于4 ℃孵育15 h后，山羊抗兔二抗于室溫孵育2 h，發光試劑(ECL)顯影，凝膠成像系統成像，其結果用軟件Image J進行分析。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 網絡藥理學分析結果

將瑞香素的結構(見圖1)導入Swiss Target Prediction數據庫預測得到瑞香素潛在靶點100個，其中Probability為0的有43個，刪除該靶點，得到有效治療靶點57個。

圖1 瑞香素的結構Fig.1 Structure of daphnetin

通過GeneCards數據庫篩選得到惡性膠質瘤靶基因426個、肝癌靶基因886個和三陰性乳腺癌靶基因1197個，所得到的靶基因取交集后得到三種腫瘤的共同靶基因253個(見圖2)。

圖2 惡性膠質瘤、肝癌、三陰性乳腺癌靶點交集的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of intersection targets of malignant glioma,hepatocellular carcinoma and triple-negative breast cancer

用Cytoscape構建瑞香素-三種腫瘤PPI圖，篩選出P53、ESR1、CUL3、MCM2、CDK2等56個基因為瑞香素抗三種腫瘤的核心靶點(見圖3)。

圖3 瑞香素潛在治療惡性膠質瘤、肝癌及三陰性乳腺癌共同作用靶點PPI網絡圖Fig.3 PPI network of potential therapeutic targets of daphnetin for malignant glioma,hepatocellular carcinoma and triple-negative breast cancer注：以節點大小和顏色深淺標識靶點連接度。Note:The node size and color in the figure indicate the target connectivity.The larger the node,the deeper the color,and the higher the connectivity.

對這56個核心靶點進行GO富集分析，發現瑞香素抗三種腫瘤的機制主要與細胞周期的調節、促進細胞凋亡以及DNA的合成和修復等生物過程有關(見圖4)。

圖4 GO功能富集分析圖Fig.4 GO functional enrichment analysis diagram

對瑞香素與惡性膠質瘤、肝癌、三陰性乳腺癌相關靶點交集基因的KEGG通路富集分析結果顯示，P53通路及癌癥通路為瑞香素抗腫瘤的主要通路(見圖5)。

圖5 KEGG通路富集分析圖Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis diagram

通過KEGG數據庫查詢到的P53通路圖顯示P53R2是DNA修復的重要通路(見圖6)。在KEGG數據庫及網絡藥理學分析中認為P53R2即為RRM2[7]，而核糖核酸還原酶M2亞基(ribonucleotide reductase subunit M2，RRM2)是調控DNA合成和修復的關鍵酶亞基[8]。

圖6 P53通路圖Fig.6 P53 pathways in KEGG database注：紅色箭頭表示p53R2(P53/RRM2)通路。Note:The red arrow indicates the p53R2 (p53/RRM2) pathway.

通過cBioPortal數據庫分析顯示RRM2在惡性膠質瘤、肝癌和乳腺癌中高表達(見圖7)。因此我們選擇對P53/RRM2通路進行實驗驗證，明確其是否是瑞香素抗三種腫瘤的共同通路。

圖7 cBioPortal數據庫中RRM2 mRNA在不同腫瘤的表達水平Fig.7 Expression level of RRM2 mRNA in different cancer in cBioPortal database注：◇：惡性膠質瘤；△：肝癌；☆：乳腺癌。Note:◇:Malignant glioma;△:Hepatocellular carcinoma;☆:Breast carcinoma.

分子對接結果顯示，瑞香素與P53蛋白的結合能為-5.7 kcal/mol，其主要是通過形成氫鍵以及疏水作用力，與Arg267(A)、Ser99(A)形成3個氫鍵，氫鍵長度分別為3.19、3.18、3.21 ?；與Leu264(A)、Ile254(A)、Pro98(A)、Thr256(A)具有疏水作用。瑞香素與RRM2蛋白的結合能為-6.7 kcal/mol，其主要是通過形成氫鍵以及疏水作用力，與Tyr323(A)、Arg330(A)分別形成4個氫鍵，氫鍵長度分別為2.87、3.19、2.80、3.24?；與Val327(A)、Ser263(A)、Phe240(A)、Met350(A)、Gly267(A)、Gly233(A)、Gys270(A)具有疏水作用。提示瑞香素與P53及RRM2均具有較好的結合作用(見圖8、9)。

圖8 瑞香素與P53蛋白對接圖Fig.8 The molecular docking diagram of daphnetin with P53 protein

圖9 瑞香素與RRM2蛋白對接圖Fig.9 The molecular docking diagram of daphnetin and RRM2 protein

通過人類蛋白圖譜數據庫獲得RRM2在正常組織(見圖10A)和腫瘤細胞系(見圖10B)中的表達水平。從中篩選出RRM2較正常腦組織和肝組織表達較高的U-251 MG、HepG-2細胞系。另外，Yun等研究顯示乳腺癌中MDA-MB231細胞系的RRM2表達較高[9]，因此我們選擇上述三個細胞系進行后續體外驗證實驗。

圖10 人蛋白質數據庫中RRM2在不同組織中的表達水平Fig.10 The expression of RRM2 in different tissues in human protein database注：A：正常組織；B：腫瘤細胞系(a：膠質瘤U-251 MG細胞系；b：肝癌HepG-2細胞系；c：乳腺癌)。Note:A:Normal tissue;B:Tumor cell lines (a:Glioma cell line U251-MG;b:Hepatocellular carcinoma cell line HepG-2;c:Breast carcinoma).

2.2 瑞香素對腫瘤細胞增殖的影響

與對照組比較，瑞香素(10、20、40、80 μg/mL)，處理腫瘤細胞48 h后，能顯著抑制U-251 MG、HepG-2、MDA-MB231細胞增殖，且呈劑量依賴性。瑞香素為10 μg/mL時，三個細胞系間，抑制率無明顯差異；瑞香素為20 μg/mL時，U-251 MG的抑制率較HepG-2、MDA-MB231高(P< 0.05)，HepG-2和MDA-MB231的抑制率無明顯差異；瑞香素為40 μg/mL時，三個細胞系間，抑制率差異明顯(P<0.01)，以HepG-2抑制率最高；瑞香素為80 μg/mL時，HepG-2抑制率最高，與U-251 MG、MDA-MB231差異明顯(P< 0.01)，而U-251 MG和MDA-MB231抑制率無明顯差異(見圖11)。

圖11 不同濃度瑞香素對腫瘤細胞的抑制率(n = 3)Fig.11 Inhibitory rate of daphnetin at different concentrations on tumor cells (n = 3)注：與對照組比較(相同細胞系內)，＊P < 0.05，＊＊P < 0.01，＊＊＊P < 0.001；不同細胞系間比較(相同濃度瑞香素)，#P < 0.05，# #P < 0.01。Note:Compared with the control group in the same cell line,＊P < 0.05,＊＊P < 0.01,＊＊＊P < 0.001;Comparison of different cell lines treated with daphnetin at the same concentration,#P < 0.05.

2.3 瑞香素對腫瘤細胞P53和RRM2蛋白表達的影響

與對照組比較，40、80 μg/mL的瑞香素處理U-251 MG、HepG-2、MDA-B231細胞48 h后，P53表達均顯著增高(P< 0.01)，RRM2的表達均顯著降低(P< 0.05)。與40 μg/mL組比較，80 μg/mL的瑞香素處理U-251 MG、HepG-2、MDA-MB231細胞48 h后，P53表達均顯著增高(P< 0.01)，RRM2的表達均顯著降低(P< 0.05)。瑞香素為40 μg/mL時，U251-MG細胞系中RRM2的表達量與MDA-MB231細胞系間差異明顯(P< 0.05)，而HepG-2和MDA-MB231細胞系間RRM2的表達量無明顯差異；瑞香素為80 μg/mL時，三個細胞系間RRM2的表達量無明顯差異。瑞香素為40 μg/mL時，三個細胞系間P53表達量無明顯差異；HepG-2抑制率最高；瑞香素為80 μg/mL時，U-251 MG細胞系中P53的表達量與HepG-2和MDA-MB231差異明顯(P< 0.05)，而HepG-2和MDA-MB231細胞系中P53的表達量無明顯差異(見圖12)。

圖12 瑞香素對U-251 MG、HepG-2和MDA-MB231細胞中P53和RRM2蛋白表達的影響(n = 3)Fig.12 Effect of daphnetin on p53 and RRM2 protein expression in U-251 MG,HepG-2 and MDA-MB231 cells (n = 3)注：A表示瑞香素(0、40、80 μg/mL)處理48 h后RRM2蛋白質印跡條帶；B表示瑞香素(0、40、80 μg/mL)處理48 h后P53蛋白質印跡條帶；C、D分別表示RRM2和P53與內參GAPDH的比率。與對照組比較(相同細胞系內)，＊P < 0.05，＊＊P < 0.01，＊＊＊P < 0.001；不同細胞系間比較(相同濃度瑞香素)，#P < 0.05。Note:After treatment with daphnetin (0,40 and 80 μg/mL)for 48 h,A and B showed Western blot bands of RRM2 and p53,respectively;C and D showed the ratio of RRM2 and p53 to GAPDH,respectively.Compared with the control group in the same cell line,＊P < 0.05,＊＊P < 0.01,＊＊＊P < 0.001;Comparison of different cell lines treated with daphnetin at the same concentration,#P < 0.05.

3 討論與結論

本研究首先采用網絡藥理學分析，發現P53通路是瑞香素抗惡性膠質瘤、肝癌和乳腺癌的共同通路。同時，本研究通過體外驗證實驗發現瑞香素在濃度為40、80 μg/mL時均能顯著抑制U-251 MG、HepG-2及MDA-MB231三種細胞的增殖，并顯著提高這三種腫瘤細胞中P53蛋白的表達水平。P53是重要的抑癌基因，其機制主要包括細胞周期阻滯、促進腫瘤細胞衰老和凋亡、抑制血管生成和腫瘤轉移以及促進DNA合成和修復和調節等[10]。我們的研究結果表明瑞香素可增加上述三種腫瘤細胞中P53表達，進而發揮抑癌作用。RRM2是P53通路中調控DNA合成和修復的關鍵酶，且在P53通路中富集[11]。大量研究也證明P53能通過RRM2調控細胞周期、DNA合成及修復，并誘導腫瘤細胞凋亡[12]。因此RRM2成為多種腫瘤治療的重要靶點[13]。

結果發現，40、80 μg/mL的瑞香素處理U-251 MG、HepG-2和MDA-MB231細胞后，其RRM2蛋白表達均顯著降低。RRM2為核糖核酸還原酶(ribonucleotide reductase，RR)中最重要的亞基，是生物體內催化DNA合成和修復的關鍵酶[14]。目前研究表明RRM2在膠質瘤、乳腺癌、肝癌等疾病中高表達，是腫瘤治療的靶點[11,15,16]，其與腫瘤細胞的侵襲轉移能力、藥物抵抗和細胞周期調控等相關[15,17,18]。

RRM2含酪氨酸自由基及Fe-S基團，故目前所開發的靶向藥物多是基于上述靶點開發，如自由基清除劑、鐵螯合劑、鐵類似物等，部分RRM2抑制劑已應用于腫瘤的臨床治療[19]，但有血液-淋巴系統代謝紊亂，肝腎功能失調，胃腸道反應等多種副作用[20]。瑞香素是一種具有鐵螯合功能的天然植物活性成分，已有研究發現瑞香素可抑制瘧原蟲中RR活性及表達[21]，我們的結果進一步證明瑞香素能抑制多種人體腫瘤細胞中RRM2蛋白的表達。因RRM2在DNA復制與修復中的重要作用，推測瑞香素能抑制多種腫瘤細胞，與其調控RRM2的表達密切相關。瑞香素可作為一種新的RRM2抑制劑應用于腫瘤的治療，且具有安全性高、分布廣等特點[22]。

綜上所述，我們的結果表明瑞香素可抑制U-251 MG、HepG-2、MDA-MB231細胞系增殖，瑞香素與P53及RRM2有較好的結合能力。瑞香素抗多種腫瘤的機制可能與P53/RRM2通路有關。瑞香素可作為一種新的RRM2抑制劑，極具開發前景。