異甾體生物堿類化合物及藥理活性研究進展

王安汶，劉玉明,2*

1天津理工大學化學化工學院；2天津市藥物靶向與生物成像重點實驗室，天津 300384

異甾體生物堿(isosteroidal alkaloids)是屬于甾體生物堿中一類結構多樣并具廣泛藥理活性的生物堿，主要分布于百合科貝母屬Fritillaria和藜蘆屬Veratrum植物中，為兩屬植物發揮藥理活性的主要成分。異甾體生物堿結構小眾，數量不多，但是其獨特的結構及藥理活性持續引起國內外學者關注。鑒于2006年前有關天然來源異甾體生物堿類研究已有總結[1,2]，因此本文綜述了十五年間(2006～2020年)新發現異甾體生物堿(共80個)的植物來源、化學結構及藥理活性，以期為異甾體生物堿類成分的進一步研發提供科學依據。

1 異甾體生物堿分類

異甾體生物堿通常具有C27骨架體系，基本骨架結構具有5～6個碳環，其特征環型為C-nor-D-homo-[14(13→12)-abeo]環系，其中包含哌啶環單元。其化學結構復雜多變，可因羥基、羰基、雙鍵等取代基團的位置和個數或構型、20或25位上的甲基構型、是否N-氧化物、D/E等環順反異構、環系開裂或新環系形成等因素而使活性產生明顯差別?，F根據骨架結構主要分為西藜蘆堿型(cevanine type)、藜蘆胺型(veratramine type)和介藜蘆型(jervine type)三類(見圖1)。

1.1 Cevanine(A)型生物堿

該類型生物堿的骨架為六個環共同駢合而成，其中A/B/D環為六元環，C環為五元環，E環或F環的18-、22-和26-位碳與同一氮原子相連。Cevanine型生物堿在貝母屬植物和藜蘆屬植物中所占比例為最多，近十五年間新發現的cevanine型生物堿共有35種，其化學結構見圖2，名稱及來源見表1。

圖1 異甾體生物堿骨架結構Fig.1 Basic skeletons of isosteroidal alkaloids

圖2 新發現cevanine型生物堿的化學結構Fig.2 Structures of new cevanine-type alkaloids

表1 新發現cevanine型生物堿的名稱及來源

1.2 Veratramine(B)型生物堿

Veratramine類型生物堿為五環架構，與cevanine型異甾體生物堿的區別在于其E環的C-N鍵斷裂。在新發現的異甾體生物堿中所占比例最低，有20種，其化學結構見圖3，名稱及來源見表2。

圖3 新發現veratramine型生物堿的化學結構Fig.3 Structures of new veratramine-type alkaloids

表2 新發現veratramine型生物堿的名稱及來源

續表2(Continued Tab.2)

1.3 Jervine(C)型生物堿

Jervine型生物堿骨架與cevanine型骨架相似，區別為E環為四氫呋喃環。在新發現的異甾體生物堿中，數量少于cevanine型結構，為25種，其化學結構見圖4，名稱及來源見表3。

圖4 新發現jervine型生物堿的化學結構Fig.4 Structures of new jervine-type alkaloids

表3 新發現jervine型生物堿的名稱及來源

植物中異甾體生物堿的含量受多種因素影響，包括溫度、產地、部位和種類等。研究表明暗紫貝母隨著海拔升高，生物堿含量隨之上升，溫度的降低有利于植物體內生物堿含量的積累，但超過一定范圍后不利于植物的生長[42]。除溫度外，不同產地同種植物中生物堿含量亦有不同，在六個浙貝母產區中，磐安(0.53%)、縉云(0.52%)、象山(0.52%)產區生物堿含量較高，而東陽(0.44%)、鄞州(0.41%)、舟山(0.38%)產區較低，且差距達到0.15%[43]。此外，浙貝母不同部位含生物堿總量也有差別，Chen等[44]測定和比較了浙貝母花、莖、鱗莖的總生物堿含量，結果顯示花為0.182 %，莖為0.047 %，鱗莖為0.341 %，這也與大多采用貝母鱗莖作為藥用部位相符。還有不同種類貝母所含生物堿總量有著極大的差異，相關研究[45]比較了平貝母、太白貝母、松貝、青貝、爐貝的總生物堿含量，測定結果顯示太白貝母(野生)>平貝母>青貝>松貝>爐貝>太白貝母(栽培)，其中太白貝母的野生品種(0.221 8%)與栽培品種(0.057 6%)的差距近四倍?？傊参镏挟愮摅w生物堿含量稀少，且受內部因素與外部因素影響而差異不小，了解這種差異對品種選育和栽培研究極具價值。目前未見對藜蘆屬植物的相關研究報道。

2 異甾體生物堿的化學合成

部分異甾體生物堿對腫瘤干細胞有抑制作用，其中最著名的當為Hedgehog(Hh)信號途徑傳導抑制劑環巴胺。天然異甾體生物堿幾乎都來源于貝母屬和藜蘆屬植物，而從中提取分離困難重重，得率不盡如人意，這使得異甾體生物堿的合成成為必然。異甾體生物堿本身的C-nor-D-homo-[14(13→12)-abeo]環型對合成有著相當大的難度，藜蘆屬植物中異甾體生物堿的生源途徑決定了工業合成幾乎難以做到[46]。目前合成研究最多的是環巴胺及其相關衍生物，早前Giannis等[47]便使用去氫表雄酮為原料合成環巴胺，反應過程共有20步，接近1%的總產率。Mousavizadeh等[48]重復了該過程，得到了相同的結果。此外Mousavizadeh及其同事還使用了路易斯酸介導的Nazarov Cyclization法，用以[C-nor-D-homo]-生物堿的一般合成以及相關轉化方法(圖5)。值得注意的是，反應最后一步轉化使用的路易斯酸僅TiCl4取得成功，其他如FeCl3、Cu(OTf)2、Sc(OTf)3、AlCl3、BF3·OEt2及Brφnsted酸(TsOH、TFA)均以失敗告終。在此之前，Heretsch等[49]便介紹了另一種合成[C-nor-D-homo]-生物堿的方法(圖6)，區別在于使用Sch?necker’s C-H活化/羥化手段脫去原料中的C-12羥基，重排形成C-nor-D-homo-環結構，并在C-12與C-13間形成碳碳雙鍵，其他相似物質的合成結果表明該方法同樣適用。C/D環的構建是異甾體生物堿合成的關鍵，Heretsch的方法針對具有特定結構的底物，而Mousavizadeh等給出的轉化方法采用簡單的雙環結構，在異甾體生物堿的合成上具有一定意義。環巴胺的合成也可以從已知相似結構的生物堿修飾得到，如將貝母辛轉化為環巴胺(圖7)，其過程簡單，并且反應條件溫和，產率高，轉化率可達93%，原料獲取較為容易[50]。還有研究報道[51]以ketone(±)-4化合物為原料，合成去氫表雄酮，這不僅為環巴胺的合成原料提供了一種解決方案，也為環巴胺的工藝路線提供了新的思路。

圖5 [C-nor-D-homo]-生物堿的合成Fig.5 Synthesis of a C-nor-D-homo-steroid

圖6 C-nor-D-homo-環合成Fig.6 C-nor-D-homo-cyclosynthesis

圖7 貝母辛轉化為環巴胺Fig.7 The conversion of peimisine to cyclopamine

Hh信號途徑被發現后，環巴胺一直是備受關注的抗癌候選物，而對其相似化合物亦多有研究。環巴胺的缺點是酸不耐受、易水解成有毒的藜蘆胺。鑒于此Rabe等[52]設計了對Hh信號途徑有著類似作用活性的類似結構，與環巴胺不同的是F環采用的是哌啶結構，并去除了C-21甲基，同樣經由去氫表雄酮原料合成得到。另為尋找酸耐受的環巴胺類似物，在環巴胺C-13位進行改性研究，其合成的類似物bis-exo-cyclopamine在C-13和C-25位均改為碳碳雙鍵，其余與環巴胺相同，在pH=1的酸性條件下，24 h后結構依然穩定，總產率可達18%[53]。

3 藥理活性

3.1 抗炎作用

炎癥癥狀程度分輕度與重度，嚴重的炎癥反應會引起病理改變，給人帶來紅腫熱痛等痛苦，甚至造成臟器功能受損和破壞，故關于炎癥的治療研究意義重大。NF-κB是已知炎癥相關的重要因素，調控著不同促炎蛋白的表達。Zhou等[54]使用基于UPLC-Q/TOF MS的綜合策略，通過PCA和ANN分析方法對五種貝母屬植物(浙貝、松貝、平貝、青貝、爐貝)的生物堿進行研究，發現浙貝中生物堿可有效抑制炎癥反應，在高劑量10 mg/mL和中劑量3 mg/mL的情況下，能夠有效抑制TNF-α誘導的HEK 293細胞中的NF-κB信號通路的表達，且劑量越高，效果越明顯，并優于其他貝母組。其分析結果表明cevanine型生物堿C-6羥基、C-20羥基和C-6羰基是抑制NF-κB信號通路的有效基團。Wu等[55]對RAW 264.7巨噬細胞促炎性介質的研究發現，川貝中西貝素和貝母素乙能夠抑制NF-κB信號通路，從而達到抑制NO的產生和促炎因子的過表達，其機制在于兩化合物可以通過抑制IκBα磷酸化來抑制NF-κB的核轉錄和轉錄活性，實驗表明兩化合物活性在0～150 μM濃度范圍內呈正量效關系。值得關注的是西貝素和貝母素乙兩者都有C-6羰基和C-20羥基取代，差別在于前者為D/E順式構型，后者是反式構型，但在抑制NO、TNF-α、IL-1β、COX-2及IκBα等促炎因子活性上無明顯差異。另在脂多糖(LPS)誘導的RAW 264.7巨噬細胞研究[56]表明：五種異甾體生物堿(imperialine、verticinone、verticine、delavine和peimisine)均能減少NO、TNF-α和IL-6產生，抑制TNF-α和IL-6的mRNA轉錄，同時這五種異甾體生物堿抗炎機制還與抑制絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)信號通路磷酸化有關。其中cevanine型生物堿因同時具有C-6羰/羥基和C-20羥基而具有較好的抗炎效果，且強于jervine型生物堿，同樣其D/E順反異構對抗炎作用沒有明顯影響。

3.2 鎮痛作用

鎮痛藥能為患者緩釋痛苦、減輕疼痛，是臨床常用藥物，但含異甾體生物堿成分的止痛藥少見。近年研究發現異甾體生物堿具有良好的止痛效果。Li等[25,37]對藜蘆屬植物大理藜蘆中提取出的異甾體生物堿進行了抗炎止痛研究，所得到的異甾體生物堿均顯示出良好的止痛作用，發現五種異甾體生物堿的鎮痛效果強于常用藥哌替啶。其中jervine型生物堿的鎮痛效果均好于哌替啶，C-1和C-3羥基取代可能對抑制活性有較大影響，如失去兩個羥基基團的dihydrojervine鎮痛活性低于其他同類生物堿，不過C-6位上羥基取代后會使活性減弱；而在veratramine型生物堿中C-3取代基種類及構型、C-6羰基取代及其共軛體系可能起主要作用。

3.3 降壓作用

血管緊張素轉化酶(ACE)普遍存在于人身體多個部位，位于肺部的ACE含量豐富且活性最高，其可強烈收縮血管，增高血壓。An等[57]評估蒲圻貝母中異甾體生物堿降壓作用時，發現veratramine型生物堿對ACE具有一定的抑制作用，其中C-6位羰基與雙鍵C-7(8)及C-14(12)形成的長共軛體系應是發揮ACE抑制作用的關鍵因素。另有研究[58]表明實驗中jervine型生物堿均有一定的降壓效果，A環和B環中羥基較多的verdine生物堿顯示出更強的降壓作用，尤其是B環6位羥基存在時降壓效果顯著；而相比較cevanine型生物堿的降壓活性不明顯。

3.4 平喘作用

哮喘是全球人群飽受折磨的呼吸道疾病，可由多種因素引起，病情頑固且難以根除，嚴重時可造成生命危險，如何有效改善和解決哮喘疾病是目前世界性疾病難題之一。Wnt/β-catenin信號通路是參與哮喘發生的重要通路，Wnt信號通路的配體Wnt5a和Wnt7b在調控氣管及肺部平滑肌中必不可少，而β-catenin在細胞的生長、增殖以及穩態維持起著重要作用。當支氣管過度收縮或拉伸時，會激活β-catenin進而促進氣道上皮細胞增殖、分化和細胞外基質生產，使組織修復、纖維化以及哮喘氣道重塑[59]。近年發現伊貝母內異甾體生物堿A22和A23均有良好的平喘作用，其平喘能力強弱為氨茶堿(pA2=7.32±0.08；EC50=0.05±0.00 μM)>A22(6.19±0.02；0.65±0.02 μM)>A23(5.58±0.09；3.00±0.68 μM)>硝苯地平(5.22±0.08；6.50±1.00 μM)，其可能的平喘作用機制即是通過抑制Wnt5a或者Wnt7b的蛋白表達，從而抑制β-catenin激活，進而阻止了哮喘氣道炎癥和氣道重塑的發生發展[15,59]。還有托里貝母中新發現的異甾體生物堿A20對ACE誘導的氣管收縮表現出明顯的舒張作用，其pA2值為5.97±0.92 μM，EC50值為3.40±4.90 μM，舒張能力與氨茶堿相當[14]。另外Cui等[60]采用網絡藥理學結合分子對接的研究方法，發現浙貝母花中異甾體生物堿貝母素甲和貝母素乙可通過作用于PTGS2、AKT1等靶點而抑制呼吸道炎癥，減少黏液分泌，抑制氣管重塑。以上表明，cevanine型生物堿應是異甾體生物堿中具有抗哮喘功效的主要結構類型，C-6位羰基以及C-20位羥基結構應是發揮抗哮喘活性不可或缺的存在，而3位羥基的糖苷化會使得活性減弱，氮氧化物的存在也會削弱其平喘作用。

3.5 抗血栓作用

Song等[61]發現黑藜蘆總生物堿有著不俗的抗血栓能力，其中分出的藜蘆?；灞P花胺是唯一在各個劑量都強于總生物堿的化合物，可能為總生物堿中起抗血栓活性的主要成分。值得注意的是，cevanine型生物堿都表現出或強或弱的抗血栓活性。從初步構效關系來看，cevanine型骨架可能是抗血栓活性所必需，而C-3位酯基的取代能夠增強其抗血栓作用。鑒于血栓與血小板的血管聚集程度相關聯，Tang等[62]對興安藜蘆進行了研究，從中得到的五種cevanine型生物堿都表現出抑制血小板聚集活性，其中15-angyloylgermine生物堿在花生四烯酸誘導的培養基上顯示了最強的抑制作用(200 μM時為100%，100 μM時為95.4%)。與之對應的veratramine型生物堿抑制率較低，僅介藜蘆胺的抑制率略高。故cevanine型生物堿可能具有普遍的抗血栓活性，可進一步作為抗血栓藥物的先導物開發，不過目前尚缺乏后續的藥代動力學和臨床數據。

3.6 膽堿酯酶抑制作用

乙酰膽堿酯酶(AChE)與丁酰膽堿酯酶(BChE)活性的增加是反映阿爾茨海默病(AD)的重要指標。AChE抑制劑是目前臨床主要使用的抗AD藥物，而對AD中后期來說BChE則是更有價值的藥物作用靶標。近年研究[11]發現cevanine型生物堿對BChE的抑制活性強于AChE，不過對這兩種酶抑制活性的強弱順序一致；與之相反jervine型生物堿則為選擇性AChE抑制劑。值得注意的是，cevanine型生物堿C-6位β羥基取代后的抑制活性強于α羥基取代，而C-20位羥基取代會導致其抑制活性消失。另外jervine型生物堿中N-αH取向、末端雙鍵和C-12羥基的存在對AChE選擇性抑制具有重要影響。再有研究表明[63]cevanine型生物堿hupeheninoside和chuanbeinone均為選擇性BChE抑制劑(IC50=2.1 μM和0.7 μM)，而C-20羥基取代的cevanine型生物堿均未表現出ChE抑制作用，N-甲基化后也極大地削弱了其抑制活性。比較特殊的是，sinpeinine A和chuanbeinone結構相近，其為cevanine型生物堿E/F環的順反異構體，但結果表明chuanbeinone抑制活性遠高于sinpeinine A，提示E/F順式構型(22-βH)有利于膽堿酯酶抑制作用。

3.7 抗病毒作用

流感病毒可引起具高發病率和高死亡率的呼吸系統疾病。Kim等[64]評估了F.thunbergii提取物對流感病毒(H1N1)感染的治療效果，體外研究結果表明：與oseltamivir對照相比(CC50：733 μg/mL；EC50：3.3 μg/mL)，F.thunbergii提取物CC50值高達7 500 μg/mL，EC50為148.2 μg/mL，說明其具有中等抗流感H1N1病毒效果，且毒性很低。且在以網絡藥理學預測F.thunbergii治療流感的潛在成分中，確立了兩個化合物天竺葵色素和β-谷甾醇及其與流感相關的九個靶基因(BCL2、CASP3、HSP90AA1、ICAM1、JUN、NOS2、PPARG、PTGS1和PTGS2)之間的相互關系，建立了成分-流感等網絡，揭示了F.thunbergii成分發揮流感治療作用的內在聯系[65]。除流感病毒外，Li等[21]報道了異甾體生物堿抗番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)的活性，顯示40 μg/mL時3-angeloylzygermine和3-angeloylgermine對TYLCV抑制率分別為74.6%和63.4%，強于陽性對照寧南霉素(51.4%)。

3.8 抗腫瘤作用

轉錄因子激活蛋白1(AP-1)調節多種蛋白質編碼基因，參與許多細胞功能，包括增殖、轉化、上皮間質轉化和凋亡。研究表明，veratramine型生物堿能對AP-1信號傳導途徑選擇性抑制或直接與AP-1中目標DNA序列的特定位點結合。AP-1下游基因位點Cd14、Mmp9、Il6等在AP-1蛋白被激活時，可受到veratramine型生物堿的抑制；而其他基因位點Fos、Jun和Myc等則受其調節激活，即veratramine型生物堿與AP-1位點的競爭結合，調控著AP-1家族蛋白的表達。而且veratramine型生物堿也能有效抑制SUV(太陽紫外線)誘導的AP-1活化，可在UV誘導的皮膚炎癥和致癌中起著重要作用[66]。天目貝母中veratramine型生物堿B18和B19均對HepG2細胞增殖有抑制作用(B18：IC50=1.73 μM；B19：IC50=1.41 μM)，且B19也顯著抑制Hela細胞增殖(IC50=0.23 μM)[12]。另外環巴胺及其衍生物的腫瘤抑制與NF-κB信號通路、Shh信號通路和Bcl-2的下調等相關，并能通過拮抗Smo受體阻斷Hh通路達到抗癌效果。環巴胺及其衍生物CUR0199691能夠抑制雌激素受體(ER)的陽性細胞或ER陰性乳腺癌細胞兩者之一的增殖揭示了其多靶向性抗癌優勢[67]。目前研究發現異甾體類生物堿抗腫瘤的作用機制多與Hedgehog信號通路、caspase-3凋亡、細胞周期和自噬有關[68]。

3.9 其他生物活性

除上述藥理活性外，異甾體生物堿還具有抗糖尿病[22]、抑制氧化應激[69]、抗錐蟲[70]等生物活性。

4 結語與展望

異甾體生物堿是百合科貝母屬和藜蘆屬植物的主要次生代謝產物，其在抗炎、鎮痛、降壓、平喘、抗血栓、膽堿酯酶抑制、抗病毒和抗腫瘤等方面具有廣泛的應用前景。但多數異甾體生物堿類成分在植物中含量過低、分離難度大制約著異甾體生物堿構效關系的深入開展；還有研究內容大多停留于單一靶點和單一活性，缺乏對其多靶向作用機制的系統研究。為此，筆者建議以下幾個研究方向的探索需加以深究：(1)繼續對成分不明的同屬植物開展化學研究，提升異甾體生物堿結構多樣性；探討同種植物不同部位化學成分及其藥用價值，尤其是貝母屬藥材的研究部位幾乎都是鱗莖，花、果、莖、葉等其他部位研究鮮見涉及；基于molecular networking 、LC-MS 、ligand fishing等技術手段進行目標化合物群的精準分離。(2)有效異甾體生物堿(如環巴胺)的簡短全合成路線和方法亟需攻克，高含量異甾體生物堿與高活性異甾體生物堿間半合成的轉化修飾值得研究。(3)加強異甾體生物堿其他藥理活性的篩選，擴大該類成分的應用范圍，實行“一物多篩”；對具抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用的單一成分進行共同作用機制溝通環節的探究，以利發現新穎靶標或未知活性。目前異甾體生物堿的研究仍處于初級階段，隨著新發現的異甾體生物堿不斷增多和藥理活性的再評價，異甾體生物堿的藥用價值定能得以充分開發和利用。