白果內酯對早產仔鼠WMI的改善作用及其機制*

姚 娟，趙 旸，李 娜，秦 霞，趙 剡

(1.湖北醫藥學院附屬十堰市人民醫院新生兒科，湖北十堰 442000；2.湖北醫藥學院附屬十堰市人民醫院兒科，湖北十堰 442000；3.武漢大學中南醫院急診科，武漢 430071)

隨著早產兒成活率的上升，幸存的早產兒腦損傷問題日益突出。腦室周圍白質損傷(white matter injury，WMI)是最主要腦損傷，不但會增加早期病死率，還可誘發諸多后遺癥，已成為新的公共衛生與社會問題[1]。據報道[2]，WMI可影響少突膠質細胞的正常分化、成熟，致大腦發育不良，是早產兒神經功能發育障礙的主要病因。目前國內外尚缺乏早產兒WMI的有效防治策略，故探討早產兒WMI的發生機制，尋找神經保護藥物尤為迫切。白果內酯是銀杏葉提取物中唯一一種倍半萜內酯化合物，具有抗氧化應激、保護線粒體功能、抗興奮性毒性等作用，被廣泛應用于缺血性腦中風、阿爾茲海默癥等腦神經損傷疾病治療。關婷等[3]證明以白果內酯為主要成分的中成藥可用于改善神經功能缺損。但白果內酯在早產兒WMI治療中的作用及其機制尚不清楚，故本研究制作早產仔鼠WMI模型，觀察白果內酯對仔鼠WMI的改善作用及其可能機制，為臨床治療早產兒WMI提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

7周齡SPF級Wistar大鼠購自北京斯貝福生物技術有限公司，雌性18只，體重(230±10)g，雄性6只，體重(210±10)g，生產許可證號SCXK(京)2019-0010。實驗開展前適應性飼養1周，飼養室溫(23±2)℃，相對濕度40%～60%，12 h自然光照，自由攝食飲水。本實驗操作符合一般動物實驗倫理學原則。

1.1.2主要試劑和儀器

白果內酯(HPLC≥98%，成都格利普生物科技有限公司)。O4抗體免疫組化試劑盒(上海赫澎生物科技有限公司，生產批號：20190506)，兔抗大鼠Ras同源基因家族成員A(RhoA)、磷酸化RhoA(p-RhoA)、Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)、重組人輕鏈Ventricular肌球蛋白2(MLC2)、磷酸化MLC2(p-MLC2)、β-actin一抗(上海鈺博生物科技有限公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(上海碧云天生物技術有限公司)。GE ImageQuant LAS 500-生物分子成像儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1造模及分組

適應性飼養結束后，將3只雌性大鼠與1只雄性大鼠同籠飼養，每天早上檢查雌性大鼠陰栓，從孕鼠中取12只建立WMI模型[4]：在雌性大鼠出現陰道栓后第16、17天注射脂多糖350 μg/kg，每天1次，同時取6只孕鼠注射等體積生理鹽水。將造模孕鼠孕期≤21 d分娩的仔鼠定義為早產WMI，分為模型組、白果內酯組、激動劑組，每組12只。將6只孕鼠足月(22～23 d)分娩的仔鼠作為對照組(10只)。4組仔鼠均與雌鼠同籠飼養，仔鼠出生3 d后開始干預，白果內酯組、激動劑組分別腹腔注射白果內酯3.5 mg/kg、Rho/ROCK通路激動劑LPA 50 μg/mL+白果內酯3.5 mg/kg干預，模型組、對照組腹腔注射等體積生理鹽水，連續干預2周。

1.2.2仔鼠神經行為學測定

仔鼠干預2周后，采取懸吊實驗、斜坡實驗、曠場實驗檢測仔鼠神經行為學。懸吊實驗：讓仔鼠前腿抓住一根水平玻璃棒(直徑0.5 cm)，離開桌面45 cm，記錄仔鼠掉下時間，計分標準：<10 s計1分，10～30 s計2分，>30 s～2 min計3分，>2～5 min計4分，>5 min計5分。斜坡實驗：仔鼠頭朝下倒置45°斜面上，記錄其轉位為頭朝上角度>135°的時間。曠場實驗：用裝置為36 cm×36 cm×36 cm的紙箱，無頂，箱底以墨線分成9個等面積小方格，將仔鼠置于中間方格上，觀察其15 s內活動情況，從所在方格中進入相鄰方格計1分，累計仔鼠15 s進入方格數并記錄總分。

1.2.3HE染色觀察仔鼠側腦室面積及腦白質病理學

干預2周后，麻醉斷頭處死并取出全腦組織，一部分凍存于-80 ℃待Western blot檢測，另一部分石蠟包埋，制作6 μm厚的冠狀腦片。HE染色：脫蠟水化后，切片浸入蘇木素液中染色細胞核，分化返藍后，浸入伊紅液中染色細胞質，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。顯微鏡觀察腦組織形態，Image J軟件量化全腦及左、右腦室面積，側腦室指數(%)=左右腦室面積之和/全腦面積×100%。

1.2.4免疫組化法檢測仔鼠少突膠質細胞凋亡情況

冠狀腦片脫蠟水化，參考O4抗體免疫組化試劑盒說明書操作：用3%過氧化氫溶液置于玻片上進行熱修復抗原，封閉玻片后，加兔抗仔鼠O4抗體(1∶500稀釋)，37 ℃孵育1 h，加生物素標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育0.5 h，DAB顯色，顯微鏡下隨機選取3個視野，用Image J軟件觀察陽性信號。

1.2.5Western blot檢測仔鼠腦組織Rho/ROCK通路相關蛋白表達

取仔鼠腦組織用RIPA裂解液裂解，BCA法定量蛋白濃度，上樣后沸水浴變性，取等量蛋白進行SDS-PAGE分離，將目的蛋白轉移到PVDF膜。將PVDF膜置入10%脫脂奶粉中封閉2 h，加入兔抗仔鼠RhoA(1∶500稀釋)、p-RhoA(1∶500稀釋)、ROCK2(1∶500稀釋)、MLC2(1∶500稀釋)、p-MLC2(1∶500稀釋)、β-actin(1∶500稀釋)一抗，4 ℃孵育過夜。次日取出PVDF膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶1 000稀釋)，避光反應1 h，加入ECL發光底物顯色。Image Quant LAS 4000 mini顯影分析目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 仔鼠神經行為學評分

與對照組比較，模型組、激動劑組、白果內酯組仔鼠懸吊實驗評分減少、斜坡實驗時間增加、曠場實驗評分減少(P<0.05)；與模型組比較，激動劑組、白果內酯組懸吊實驗評分增加、斜坡實驗時間減少、曠場實驗評分增加(P<0.05)；與激動劑組比較，白果內酯組懸吊實驗評分增加、斜坡實驗時間減少、曠場實驗評分增加(P<0.05),見表1。

表1 仔鼠神經行為學評分

2.2 仔鼠側腦室指數

HE染色結果顯示：與對照組比較，模型組仔鼠側腦室面積增大，側腦室指數升高(P<0.05)；與模型組比較，激動劑組、白果內酯組側腦室面積減小，側腦室指數下降(P<0.05)；與激動劑組比較，白果內酯組側腦室面積減小，側腦室指數下降(P<0.05)，見圖1。

2.3 仔鼠腦白質病理學

對照組仔鼠腦白質染色清晰，結構正常，細胞排列正常，核大而深染；與對照組比較，模型組腦白質染色淡，結構稀疏，細胞排列紊亂，核固縮；激動劑組、白果內酯組腦白質染色、結構、細胞排列等均明顯改善，見圖2。

A：對照組；B：模型組；C：激動劑組；D：白果內酯組。圖1 HE染色觀察仔鼠側腦室擴張情況(×400)

2.4 仔鼠少突膠質細胞凋亡情況

免疫組化染色顯示，對照組仔鼠胼胝體、扣帶回處O4表達豐富，陽性細胞數多；與對照組比較，模型組仔鼠O4陽性細胞數明顯減少；與模型組比較，激動劑組與白果內酯組O4陽性細胞數有所增加,見圖3。

A：對照組；B：模型組；C：激動劑組；D：白果內酯組。圖2 仔鼠腦白質HE染色(×400)

2.5 仔鼠腦組織Rho/ROCK通路相關蛋白表達

各組仔鼠腦組織RhoA、MLC2蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)，p-RhoA、ROCK2、p-MLC2蛋白表達比較差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組、激動劑組、白果內酯組p-RhoA、ROCK2、p-MLC2蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，激動劑組、白果內酯組p-RhoA、ROCK2、p-MLC2蛋白表達降低(P<0.05)；與激動劑組比較，白果內酯組p-RhoA、ROCK2、p-MLC2蛋白表達降低(P<0.05)，見表2、圖4。

A：對照組；B：模型組；C：激動劑組；D：白果內酯組；→：O4陽性細胞。圖3 仔鼠少突膠質細胞凋亡免疫組化(×400)

表2 仔鼠Rho/ROCK通路相關蛋白表達

A：對照組；B：模型組；C：激動劑組；D：白果內酯組。圖4 各組仔鼠Rho/ROCK通路相關蛋白電泳圖

3 討 論

WMI為早產兒腦病主要表現形式，對早產兒神經系統正常發育造成極大影響，往往遺留腦癱、認知及視聽功能障礙等后遺癥[5]。目前，關于早產兒WMI的發生機制尚不清楚，ALTENDAHL等[6]認為圍生期子宮炎癥改變了腦白質發育過程，為誘發早產兒WMI的主要因素，故本研究采用腹腔注射脂多糖致子宮炎癥的方法。目前國內外對早產兒WMI尚無統一特效治療標準，探索新的神經保護藥物是治療該病的關鍵方向。白果是一種藥用價值顯著的天然植物，藥用歷史悠久，白果內酯為其主要藥效成分，有抗炎、抗血小板聚集等作用，長期用于增強免疫力、防治心腦血管疾病治療[7-8]。白果內酯已經進入神經系統疾病相關的臨床實驗研究中，但對早產WMI動物模型研究的數據鮮見。本研究主要從早產仔鼠WMI側腦室及腦白質病理損傷、少突膠質細胞特殊標記物表達角度，初步探討白果內酯對早產仔鼠WMI的神經保護作用，為今后臨床防治早產兒WMI提供參考。

懸吊實驗、斜坡實驗、曠場實驗為公認的神經行為學檢測方法，指標可觀，可快速獲得數據。懸吊實驗可評估仔鼠隨意運動能力，斜坡實驗評估軀體協調與平衡能力，曠場實驗評估仔鼠運動活力。本研究結果顯示：與模型組比較，白果內酯組懸吊實驗評分增加、斜坡實驗時間減少、曠場實驗評分增加，提示白果內酯可改善早產仔鼠WMI的神經行為學。側腦室擴張是WMI主要癥狀表現，經HE染色觀察仔鼠側腦室與腦白質病理學發現，與模型組比較，白果內酯組側腦室面積減小，側腦室指數下降，腦白質結構、染色、細胞核變化等均明顯改善，提示白果內酯可抑制WMI癥狀，減輕WMI。少突膠質細胞是腦白質的主要成分，為軸突提供營養支持與能量，參與維持神經元軸突信號傳遞與神經功能[9]。CHAVALI等[10]報道，少突膠質細胞凋亡參與了WMI。宮內感染激活胎兒小膠質細胞，介導了細胞因子、補體、白細胞等參與的免疫性炎癥，損傷少突膠質細胞前體細胞，抑制了髓鞘形成，從而出現嚴重WMI。O4為少突膠質細胞前體細胞的生物標記物，在細胞膜上呈陽性表達，早產兒發生WMI時，少突膠質細胞分化過程受阻，可導致O4表達水平下降[11]。本研究通過免疫組化染色檢測O4表達水平，評估少突膠質細胞分化程度，結果顯示：與模型組比較，白果內酯組仔鼠腦白質O4陽性細胞數增加，提示白果內酯可抑制少突膠質細胞凋亡，可能與其抗炎作用有關。

Rho蛋白是小分子G蛋白，RhoA為Rho家族成員之一[12]。研究表明腦白質髓鞘抑制因子是通過活化RhoA這一共同分子開關信號通路，誘發一系列反應，影響軸突再生，最終損傷腦白質。RhoA為ROCK最早發現的Rho效應物，可能是腦白質軸突生長的抑制性蛋白發揮作用的焦點[13]。ROCK是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，為RhoA下游靶效應分子，根據基因編碼不同分為ROCK1和ROCK2兩種亞型[14]。其中，ROCK2主要表達于大腦皮層、海馬椎體神經元，據報道ROCK2在小鼠出生后大腦發育階段的表達上調[15]。Rho受外界刺激活化后，將活化信號傳遞到下游靶分子——ROCK后，作用于其底物MLC，直接使其磷酸化，從而調控細胞動態變化。據報道[16]，Rho/ROCK通路異常激活與WMI相關，但多數報道集中于缺血性動物模型中。本研究結果顯示：與模型組比較，激動劑組、白果內酯組p-RhoA、ROCK2、p-MLC2蛋白表達降低，其中以白果內酯組上述蛋白表達最低，提示白果內酯可能通過下調Rho/ROCK通路改善早產仔鼠WMI。

綜上所述,白果內酯可能通過下調Rho/ROCK通路，抑制少突膠質細胞凋亡，從而減輕早產仔鼠WMI。