萌發對小粒黑豆活性組分及抗氧化能力的影響研究

劉宏瑀，宋艷麗，王可心，高玉萌，高小麗

(西北農林科技大學農學院；旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，楊凌 712100)

小粒黑豆是黃土高原地區主栽的黑色大豆品種之一，尤以陜北等地栽培較多，因具有極強的抗逆性和適應性，其在當地農業生產中占有重要地位[1]。小粒黑豆既含有豐富的蛋白質、不飽和脂肪酸和其他礦質元素，又含有黃酮、酚類物質、花色苷等生物活性成分[2, 3]，可開發成多種食藥兼用型產品[4, 5]。

在食品加工領域中，萌發處理是用來改善種子品質的一種重要方法。萌發作為一種經濟有效的加工方式，能夠迅速打破大豆種子的休眠狀態，激活其內源酶[6, 7]和各種代謝通路[8]，提高種子中活性成分的含量，從而改善其營養保健功能。同時，萌芽處理還能有效降低大豆中脂肪酸氧化酶、植酸、植物凝集素等抗營養因子的含量, 提高其食用價值[9]。酚類是芳香烴環上連接1個或多個羥基的化合物,其有助于提高植物性食物整體的抗氧化性,是極佳的營養保健活性成分[10]。發芽可顯著提高豆類的酚類物質含量，且在發芽后期出現最大值[11,12]。Aguilera等[13]研究表明，綠豆和扁豆發芽后總酚類物質增加，抗氧化活性增強。大豆中的黃酮類物質是天然的有效活性成分，其具有抗氧化、提高機體免疫功能和調節血脂血壓等作用[14]。未經處理的大豆異黃酮含量極低，經萌芽處理后，異黃酮含量顯著增加[15]。李振艷等[16]研究發現，發芽48 h的大豆異黃酮含量相比于未發芽的干大豆上升了92.1%。王莘等[17]發現不同豆類的活性物質含量達到最大值的萌發時間不同，大豆、綠豆和黑豆的異黃酮在萌發40、39、54 h時達最大值，皂苷則在萌發20、39、54 h時達最大值。羅旭等[18]發現4種大豆抗氧化能力與總多酚、總黃酮、異黃酮含量顯著相關，曾慶真等[19]利用DPPH和ORAC法測定大豆萌發過程中芽、莖和子葉的抗氧化活性，也得出了相同的結論。由此可見，萌芽可作為提高豆類活性成分含量和改善豆類抗氧化功能的重要手段之一，研究萌發對小粒黑豆活性組分及抗氧化能力的影響對其開發利用具有指導意義。

目前關于萌發對小粒黑豆功能特性的影響研究鮮有報道，本研究探討小粒黑豆萌芽過程中活性組分及抗氧化能力的變化規律，旨在揭示小粒黑豆萌芽期間的功能特性，為小粒黑豆芽菜生產及多元化開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以黃土高原“神木連枷條”、“定邊小黑豆”和“子洲小黑豆”品種為實驗材料，分別簡稱SM、DB和ZZ。

1.2 發芽小粒黑豆樣品的制備

挑選籽粒飽滿且無病害的不同品種小粒黑豆種子各300 g左右，3次重復。首先用蒸餾水沖洗表面的雜質和懸浮癟粒，然后取適量蒸餾水浸泡3 h。浸泡結束后，再用蒸餾水沖洗除去豆子表面黏性雜質。將浸泡后的小粒黑豆表面的水分瀝干后，放入發芽機中，均勻攤開鋪平，并用遮光布進行遮光，發芽溫度控制在23～28 ℃左右。發芽過程中，每隔2 d進行沖洗并換水。每隔1 d取樣，樣品冷凍干燥后，粉碎、過篩、脫脂后測定活性成分和相關指標。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 提取液的制備

參考Prior等[20]和Korus等[21]方法制備提取液，并稍作修改。稱取2 g脫脂后小粒黑豆粉，在25 ℃下用25 mL 70%丙酮以150次/min的振蕩頻率提取3 h，4 000 r/min離心10 min，收集上清液。殘留物在25 ℃下用25 mL 70%丙酮再次振蕩提取3 h，4 000 r/min離心10 min，然后合并提取液，-20 ℃保存備用。

1.3.2 活性組分含量的測定

1.3.2.1 總酚含量的測定

參照Xu[22]的方法，采用福林酚(Folin-Ciocalteu)法測定，以沒食子酸濃度為橫坐標，以A765值為縱坐標做標準曲線，樣品中的總酚含量以沒食子酸計。沒食子酸濃度與A765值之間具有極顯著的線性關系，線性關系為y=71.196x+0.025，決定系數R2=0.995 9。

1.3.2.2 總黃酮含量的測定

參照Jia等[23]的方法，用蘆丁制作標準曲線。以蘆丁濃度為橫坐標，以A510值為縱坐標做標準曲線，樣品中的總黃酮含量以蘆丁計。蘆丁濃度與A510值之間具有極顯著的線性關系，線性關系為y=10.401x-0.065 9，決定系數R2=0.992 5。

1.3.2.3 總花色苷含量的測定

參照Jeng等[24]的方法，采用pH示差法測定，樣品中的總花色苷含量以矢車菊素-3-葡萄糖苷計。

1.3.3 抗氧化能力的測定

1.3.3.1 DPPH·清除能力的測定

參照Xu[22]的方法，將方法中的無水甲醇換成無水乙醇。

1.3.3.2 O2-·清除能力的測定

參照Beauchamp等[25]方法。

1.3.3.3 ·OH清除能力的測定

參照Li等[26]的方法。

1.3.4 數據統計與分析

采用Duncan’s多重比較法進行顯著性分析，Origion 2021進行繪圖，SPSS 25.0軟件進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 萌發對小粒黑豆活性組分的影響

2.1.1 總酚含量的變化

植物多酚類物質是一類廣泛存在于植物體內的多元酚化合物，是天然的抗氧化劑。由圖1可知，SM和ZZ各發芽時期的總酚含量差異顯著，隨著發芽時間的延長，SM、DB和ZZ總酚含量均呈持續升高的趨勢。3種小粒黑豆均在芽菜生長的第5天總酚含量達到最高值，分別為9.93、12.21、15.72 mg/g，相比發芽第1天依次上升了70.62%、58.78%、151.12%，可見發芽有利于小粒黑豆中多酚的累積，其中ZZ對多酚的積累效果最為明顯。有研究發現大豆總多酚含量隨萌發時間延長呈持續上升趨勢[27]，秦高一鑫等[28]在豌豆中也發現了同樣的規律，這與本研究結果一致，可能是豆粒在萌芽過程中，受到外界環境因子的影響以及自身結構的改變，內源酶作用植物組織合成具有活性的次級代謝產物，使多酚含量顯著提高。

圖1 萌發過程中豆芽總酚含量

2.1.2 總黃酮含量的變化

目前，關于豆類中黃酮含量的研究較少，大多是關于異黃酮的研究[29, 30]。黃酮類化合物是小粒黑豆中的主要活性物質之一。由圖2可以看出，小粒黑豆的總黃酮含量隨著萌發天數的增加，基本上呈現先升高后降低的單峰變化趨勢。SM和ZZ在萌發第3天時總黃酮含量最高，分別為3.58、5.63 mg/g，相比于萌發第1天分別上升了17.38%和86.42%，ZZ在萌發第3天時總黃酮含量急劇上升，為第2天的1.72倍。DB的總黃酮含量在萌發第2天和第3天差異并不顯著，其在萌發第4天時達到峰值，為3.26 mg/g。本研究結果與張桂芳等[31]的研究結果一致，這可能是由于大量生物酶在萌發前期被激活，刺激了種子中活性物質的釋放，但隨著萌發時間的延長，在酶催化作用下形成的黃酮類化合物結構發生改變，無法與Al3+形成穩定的鋁絡合物，從而引起測定的總黃酮含量降低。

圖2 萌發過程中豆芽總黃酮含量

2.1.3 總花色苷含量的變化

花色苷是重要的抗氧化活性物質，能夠與自由基反應清除自由基從而消除氧化作用。由圖3可以看出，小粒黑豆在萌發后1～5 d內，其總花色苷含量呈現明顯的單峰變化趨勢，花色苷含量在發芽前期增長較快，SM、DB和ZZ在萌發第1、2、3 天時的總花色苷含量均存在顯著差異。SM、DB和ZZ分別在萌發第3、4、3天達到最高值，依次為19.41、15.86、24.64 mg/g，分別是萌發第1天的1.95、3.10、11.79倍，ZZ對花色苷的富集作用最為顯著。

圖3 萌發過程中豆芽總花色苷含量

2.2 萌發對小粒黑豆抗氧化能力的影響

2.2.1 DPPH·清除能力的變化

豆類萌發過程中，籽粒中儲藏的物質發生分解，合成新的化合物，這一生理生化特征發生顯著變化的活躍過程會促使多酚、黃酮、GABA等活性物質含量急劇上升，并且隨著發芽時間的延長，DPPH·清除等抗氧化能力增強[32, 33]。由圖4可以看出，在發芽第1天，3種小粒黑豆的DPPH·清除能力均在30%左右。隨著發芽時間的延長，SM、DB和ZZ的 DPPH·清除能力呈現出不同的趨勢。SM在萌發的第2天出現凹谷現象，其第2天的DPPH·清除能力為28.63%；DB呈現先升高后降低的趨勢，在第3天達到最大值44.96%；ZZ則呈持續升高的變化趨勢，在第5天達到峰值，為49.74%，相較萌發第1天上升了58.86%。

圖4 萌發過程中豆芽清除DPPH·能力

2.2.2 O2-·清除能力的影響

由圖5可以看出，不同品種小粒黑豆在萌發的1～5 d內，O2-·的清除能力基本呈現持續升高的趨勢，均在芽菜生長的第5天達到最大值，SM，DB和ZZ最大清除率分別為54.54%、43.77%和44.71%，依次是萌發第1天的1.83、1.53、1.93倍，可見萌發能夠有效提高小粒黑豆的O2-·清除能力。

圖5 萌發過程中豆芽清除O2-·能力

2.2.3 ·OH清除能力的變化

由圖6可以看出，不同品種小粒黑豆萌發過程中·OH清除能力不同，在萌發第1天，3種小粒黑豆的·OH清除能力在57%～62%之間。隨著萌發天數的增加，DB和ZZ的·OH清除能力呈先升高后降低的趨勢，分別在萌發的第2、4天達到峰值，峰值依次為70.50%和60.54%；SM的·OH清除能力呈“波浪形”，先增強后減弱，在第3天出現最低值54.05%，之后再增強，并在第5天達到峰值68.68%。不同品種小粒黑豆在萌發過程中·OH清除作用變化趨勢不同，如SM在萌發過程中，隨著萌發天數增加，·OH清除能力表現出先升高后降低，然后再升高兩個極值的現象，這與魏美霞等[34]、郭鴿等[35]在綠豆和大豆上的研究結果相似，但DB和ZZ與此結果不完全一致，可能是由于品種特性和遺傳因素不同，在萌發過程中產生了其他影響自由基清除作用的物質，具體原因有待進一步探索。

圖6 萌發過程中豆芽清除·OH能力

2.3 萌發過程中小粒黑豆活性組分與抗氧化能力的相關性分析

對小粒黑豆總酚、總黃酮、總花色苷、DPPH·清除能力、O2-·清除能力和·OH清除能力進行相關性分析，結果見表1。ZZ的DPPH·清除能力與總酚含量呈極顯著正相關關系，DB的DPPH·清除能力與總黃酮和花色苷含量均呈顯著正相關關系，SM和ZZ的O2-·清除能力和總酚含量均呈顯著正相關關系。相關性分析結果表明，3種小粒黑豆抗氧化能力大小與總酚、總黃酮、總花色苷中某一成分含量高低有關。不同品種之間黃酮、總酚及花色苷含量與抗氧化性能力的相關性存在一定的差異，這可能與品種特性和遺傳因素有關，具體原因有待進一步探索。

表1 抗氧化能力與活性組分含量的相關性分析

3 結論

萌發能夠顯著提高小粒黑豆活性物質含量和抗氧化能力。參試的3種小粒黑豆在萌芽過程中，總酚含量、花色苷含量均呈不斷上升趨勢，O2-·清除能力的增強效果最為顯著。“子州小黑豆”出現峰值時的總黃酮、總酚和花色苷含量均顯著高于其他兩個品種。相關性分析表明，“子洲小黑豆”的DPPH·清除能力和O2-·清除能力與總酚含量分別呈極顯著正相關和顯著正相關關系。相對而言，“子洲小黑豆”更具有開發功能性產品的潛力。萌發處理可作為一種提高小粒黑豆及其制品營養價值和生物利用率的有效方法，但不同品種以及萌發時間都會對產品的活性組分及抗氧化能力產生一定的影響，因此，生產上可根據產品加工對各功能成分的需求選擇優質專用品種，并確定適宜的萌發時間。