菜籽餅粕中多肽的提取純化及抗腫瘤活性

熊 川， 羅 強， 黃文麗， 李 萍， 張 娟， 金 鑫， 朱 宇

(四川省農業科學院生物技術核技術研究所1，成都 610061) (重慶醫科大學附屬第二醫院感染病分子重點實驗室肝炎研究所2，重慶 623000) (四川省農業科學院茶葉研究所3，成都 610066)

油菜籽，十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)作物油菜(BrassicanapusL.)的種子，是世界范圍內最主要的植物油原料之一。我國是油菜種植大國，國家統計局數據顯示，2019年我國油菜種植面積為6 583.09 hm2，油菜籽產量為1 348.47萬t，占世界總年產量的四分之一[1]。我國油菜籽主要用以食用油的生產，浸提或壓榨后會產生大量的菜籽餅粕。目前，受制于提取加工技術研究的匱乏，菜籽餅粕主要用于燃料與肥料，其經濟價值尚存極大的開發空間。菜籽餅粕營養成分含量豐富，富含蛋白質、碳水化合物、脂質、礦物質和維生素等[2]。此外，菜籽餅粕氨基酸組成接近聯合國糧農組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)推薦值，氨基酸分布平衡，含有豐富的含硫氨基酸及一定量的賴氨酸，是一種優良的天然植物蛋白資源[3]。因此，深入研究菜籽餅粕的蛋白質提取利用，對提高油菜籽產業價值鏈具有重大意義。

植物蛋白提取中關鍵的一步是破碎細胞壁以促進蛋白質溶出，一般包括單一球磨、高壓均化處理，酶法以及物理法等[4]，這些操作方法復合使用，能夠有效去除部分纖維及還原糖，提高蛋白提取率和純度[5]。以菜籽餅粕為原材料，獲得的菜籽餅粕蛋白需要進一步酶解以獲得菜籽餅粕多肽，酶解法具有反應條件溫和、效率高、不產生消旋作用等優點，但是蛋白酶具有底物專一性，因此篩選合適的蛋白酶是酶法制備多肽的重要步驟[6]。菜籽餅粕多肽多是相對分子質量小于5 000 u的小肽，傳統分離方法的區分精度受限，因此，需結合凝膠過濾色譜和反向高效液相色譜進行純化。

多肽(polypeptide)是α-氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物，也是蛋白質水解的中間產物，是源于蛋白質的多功能化合物，且通常情況下營養和生理功能優于蛋白質(大分子蛋白質)和氨基酸。目前，獲得的多肽藥物主要包括多肽疫苗、抗腫瘤多肽、抗病毒多肽等，多肽藥物與一般的有機小分子藥物相比，具有生物活性強、用藥劑量小、毒副作用低和療效顯著等突出特點[7]。菜籽餅粕是提取天然植物多肽的理想來源，目前，來源于菜籽的蛋白已有相關報道，菜籽球蛋白(Cruciferin)為11/12S球蛋白，富含賴氨酸和甲硫氨酸，平均分子量為300～360 ku，具有良好的凝膠特性[8]。菜籽白蛋白(Napin)為1.7/2S白蛋白，富含脯氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸，具有良好的溶解性、成膜性、較高的熱穩定性及耐胃蛋白酶特性[9]。但鮮有針對菜籽餅粕多肽及其生理活性的報道。

本研究以菜籽油生產的副產物菜籽餅粕為原料，綜合物理法和酶法進行提取，聯用凝膠過濾色譜和反向高效液相色譜進行多肽的純化，建立一套適宜于菜籽餅粕分離純化的方法。進一步構建細胞模型，探索菜籽餅粕多肽的抗腫瘤活性，最終鑒定出具有抗腫瘤活性的多肽，為多肽類藥物和菜籽油產業的深度開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菜籽餅粕自然干燥，過100目篩后獲得干粉，備用；人宮頸癌Hela細胞系、胎牛血清、DMEM培養液、青霉素、鏈霉素，3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍(MTT、Caspase檢測試劑盒)、細胞色素C檢測試劑盒；其余試劑均為分析純。

Delta 1-24 LCS真空冷凍干燥機，Microfuge 20R高速離心機，Forma 3111 CO2細胞培養箱，Quest 10中高壓層析系統，1260 Infinity II半制備型高效液相色譜，N-1210BS-WB旋轉蒸發儀，SpectraMax L酶標儀，CKX53倒置顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 菜籽餅粕多肽提取與純化

1.2.1.1 菜籽餅粕總蛋白提取

稱取菜籽餅粕干粉50 g，置于燒杯中，按照菜籽餅粕干粉/PBS緩沖液(pH 6.8)的料液比1∶20加樣，放入超聲-微波協同萃取儀中，微波功率80 W，處理時間8 min，處理結束后轉速4 000 r/min條件下離心20 min，吸取上清液，計算蛋白的提取率。

式中：V為菜籽餅粕蛋白提取液的總體積/mL；W1為提取液中蛋白的含量/g/100 mL；m為菜籽餅粕的質量/g；W2為菜籽餅粕中蛋白的含量/g/mL，W1和W2采用凱式定氮法測定。

1.2.1.2 菜籽餅粕多肽的分離

通過前期預實驗，選用堿性蛋白酶Protex6L作為菜籽餅粕總蛋白的水解酶。水解條件設定為：底物添加質量分數2%，加酶量5 500 U/mL，通過添加濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液保證反應中pH維持在10，反應時間設定為2 h，溫度設定為55 ℃，反應后6 000 r/min條件下離心5 min收集上清液，冷凍干燥獲得菜籽餅粕總多肽干粉。

取菜籽餅粕總多肽干粉5 g，無菌水溶解，配制成50 mg/mL的溶液，上樣于Superdex 30 Increase 凝膠過濾柱，無菌水洗脫，通過Bio-rad的Quest 10中高壓層析系統收集洗脫液，215 nm下測定吸光值，收集并凍干單一峰，得到菜籽餅粕總多肽復合物。

1.2.1.3 菜籽餅粕多肽的純化與鑒定

取菜籽餅粕總多肽復合物1 g，無菌水溶解，配制成10 mg/mL的溶液，反相高效液相色譜法(RP-HPLC)純化，收集單一峰，冷凍干燥獲得菜籽餅粕多肽。反相高效液相色譜條件設定為：采用C18色譜柱，流動相A相為純凈水，流動相B相為含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；單針進樣量為30 μL，測定流速設定為1.0 mL/min，檢測波長為215 nm；檢測洗脫條件設定為：A相為0～6 min，99%～97%；6～10 min，97%～96%；10～16 min，96%～80%；16～22 min，80%～99%。

通過解析菜籽餅粕多肽的氨基酸序列。液相A液為含0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈溶液。色譜柱以A液平衡。樣品由自動進樣器上樣，再經色譜柱梯度分離，流速為0.3 mL/min，柱溫70 ℃。質譜條件：樣品用TripleTOF 5600+質譜儀進行質譜分析。分析時長18 min，檢測方式：正離子，一級質譜掃描范圍：600～3 500 m/z。

1.2.2 菜籽餅粕多肽形態觀察

取質量為1 mg的菜籽餅粕多肽置于附有銅膠帶的樣品臺，通過離子濺射儀在樣品表面鍍上一層導電金粉，置于掃描電鏡下觀察。樣品在20.0 kV加速電壓下進行檢查[10]，選擇清晰的視野拍照。

取質量為1 mg的菜籽餅粕多肽溶解于蒸餾水中，配制成0.25 mg/mL的溶液，25 ℃進行圓二色譜測定，在190～260 nm范圍內，以1 nm間隔和1 nm帶寬采集數據。

1.2.3 菜籽餅粕多肽對Hela細胞存活率的影響

通過含有10%FBS的DMEM培養基培養Hela細胞，取對數期細胞接種于96孔板，調整細胞密度為1×105個/mL，每孔加入細胞懸液100 μL，96孔板置于5% CO2培養箱37 ℃培養。待細胞貼壁后，將細胞分為7組，每組8個復孔，分別為對照組(100 μL含血清DMEM培養基)和6個菜籽餅粕多肽組(含有菜籽餅粕多肽的培養基)，菜籽餅粕多肽的最終質量濃度依次為12.5、25、50、100、200、400μg/mL，空白孔不接種細胞，加入100 μL含血清DMEM培養基，CO2培養箱培養12 h。采用MTT法測定細胞存活率。

1.2.4 脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)染色

按照3×105個/孔的密度接種Hela細胞于6孔板中，待細胞貼壁后，加入不同濃度(50、100、200 μg/mL)的菜籽餅粕多肽處理12 h。丟棄培養基，每個孔中的細胞用預冷的PBS溶液洗滌3次。然后用4%多聚甲醛固定細胞1 h，在冰上用滲透溶液(0.1%Triton X-100和0.1%檸檬酸鈉)處理細胞2 min。最后將細胞重新懸浮在含有10 μL TUNEL反應化合物的200 μL PBS溶液中，并在37 ℃下培養1 h，用倒置熒光顯微鏡觀察染色情況[11]。

（1）大跨度巷道不同的開挖順序對巷道圍巖破壞區域、應力分布和位移量均有明顯的影響，先開挖小斷面有利于巷道頂底板的穩定，而先開挖大斷面有利于巷道兩幫的穩定。

1.2.5 Hela細胞線粒體膜電位測定

通過5,5,6,6-四氯-1,1,3,3-四乙基咪唑啉碘化物(JC-1)測定線粒體膜電位的變化。將Hela細胞以密度為3×103個/孔接種于96孔板中，細胞培養箱中培養12 h。待細胞貼壁后，將不同質量濃度(50、100、200 μg/mL)的菜籽餅粕多肽添加到細胞中繼續培養12 h。PBS溶液重懸細胞。加入JC-1于Hela細胞中，最終質量濃度為2.5 μg/mL，反應15 min。使用FACS Calibur流式細胞儀記錄熒光強度，計算得出Hela細胞的線粒體膜電位的變化。

1.2.6 細胞色素C釋放測定

通過蛋白免疫印跡法測定Hela細胞中細胞色素C的釋放情況。Hela細胞以3×105個/孔接種于6孔板中，細胞培養箱培養12 h，細胞貼壁后用不同質量濃度(50、100、200 μg/mL)的菜籽餅粕多肽處理12 h。預冷的PBS緩沖液沖洗細胞2次，使用細胞色素C釋放凋亡檢測試劑盒提取細胞線粒體和胞漿蛋白質。收集的蛋白質部分裝載在12%SDS-PAGE凝膠上，并通過標準的Western印跡法進行分析[12]。一抗選擇細胞色素C抗體(細胞色素C兔單克隆抗體4280)，二抗選擇GAPDH。

1.2.7 Caspase表達活性

Hela細胞按照密度為3×103個/孔接種于96孔板中，細胞培養箱中培養12 h。待細胞貼壁后，將不同質量濃度(50、100、200 μg/mL)的菜籽餅粕多肽添加到細胞中繼續培養12 h。通過PBS溶液清洗，采用Caspase-9和-3活性檢測試劑盒完成Caspase活性檢測。重懸并收集細胞，加入裂解液并于冰上裂解5 min，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，反應緩沖液處理，405 nm下測定吸光值。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 菜籽餅粕的分離純化

通過磷酸鹽緩沖液(PBS)提取，結合超聲-微波萃取，獲得菜籽餅粕總蛋白的得率為(68.82±2.23)%。堿性蛋白酶Protex6L水解菜籽餅粕總蛋白，獲得菜籽餅粕總多肽的得率為(34.41±1.96)%。

2.1.2 菜籽餅粕多肽(RMP)純化及鑒定

將提取獲得的菜籽餅粕總多肽上樣于Superdex 30 Increase凝膠過濾柱進行純化，圖1a顯示，菜籽餅粕總多肽依據分子量的大小能夠獲得3個洗脫峰，經過堿性蛋白酶Protex6L水解后，菜籽餅粕多肽分子量較小，出峰較晚。通過抗腫瘤活性的初篩，選擇A2組分進一步分離純化。如圖1b所示，A2上樣于RP-HPLC后，能夠分離出4個組分，通過對Hela細胞生長的抑制作用初篩，B3組分具有最好的抑制活性，因此收集B3組分作為菜籽餅粕多肽(RMP)。最終通過LC-MS-MS測定，確定RMP的氨基酸組成為Asp-Val-Phe-Val-Pro-Pro-Val-Leu(圖1c)，相對分子質量為886 u。

圖1 RMP的分離純化

2.2 RMP的形態觀察與測定

在掃描電鏡下，RMP呈現不規則的片狀結構，片狀結構的邊緣出現不規則的卷曲(圖2a)。圓二色譜的結果顯示，如圖2b，RMP在198 nm附近有一吸收帶，在220 nm附近有一較弱吸收帶，上述特征吸收表明RMP具有不規則二級結構，進一步的統計分析證實，在水溶液中，48.9%的LRP呈無規卷曲，31.7%的LRP呈β-折疊。

圖2 RMP的形態觀察與二級結構

2.3 RMP對Hela細胞活性的影響

RMP處理Hela細胞24 h，通過MTT法測試細胞的存活率。結果如圖3所示，較低濃度的質量濃度介于12.5～25 μg/mL的RMP對于Hela細胞的活性未見明顯影響。隨著RMP濃度的升高，逐漸表現出對Hela細胞的抑制作用，50 μg/mL的RMP對Hela細胞的抑制率為18%，200 μg/mL的RMP則超過50%，RMP濃度進一步提高，對Hela細胞的抑制率則未見顯著提升。因此，后續實驗中RMP的作用質量濃度設定為50、100、200 μg/mL。

注：與對照組相比，*P<0.05, **P<0.01)。圖3 RMP的細胞毒性

2.4 RMP誘導Hela細胞凋亡

為了確定RMP對Hela細胞增殖的抑制作用是否是由于細胞凋亡引起的，通過TUNEL法觀察Hela細胞DNA斷裂情況(圖4)。結果發現，由于4′, 6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)的存在，所有細胞的細胞核會被激發出藍色熒光，而由于4甲基羅丹明-5-dUTP的存在會使得凋亡細胞的細胞核激發出紅色熒光。因此，在熒光顯微鏡下，凋亡細胞的細胞核呈現淡綠色熒光。圖4中，未處理的Hela細胞的細胞核呈現藍色熒光。不同濃度的RMP處理后，某些細胞發生凋亡，細胞核呈淡綠色，而其他細胞依舊保持藍色，且隨著RMP作用計量的增加，細胞核呈現淡綠色熒光的細胞數量呈劑量依賴性增加。

圖4 RMP引起Hela細胞細胞核形態變化觀察 (比例尺=50 μm)

2.5 RMP誘導Hela細胞凋亡的機理探索

2.5.1 RMP對Hela細胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位較高時，JC-1在基質中匯聚形成聚合物(J-aggregates)，可以產生紅色熒光，而線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體基質中，以單體形式存在而產生綠色熒光。圖5表明，正常細胞中，JC-1聚合物與單體的比率為(1.58±0.07)，RMP處理后，Hela細胞的線粒體膜電位顯著下降，且與RMP的濃度呈現計量依賴關系，200μg/mL的RMP處理12 h，聚合物與單體的比率降低為(0.18±0.02)。

注：不同小寫字母代表5%水平的差異。圖5 線粒體膜電位分析

2.5.2 RMP對Hela細胞中細胞色素C釋放的影響

如圖6所示，正常培養的Hela細胞中未能在胞漿中檢測到細胞色素C的存在，RMP作用后，Hela細胞胞漿中的細胞色素C含量顯著升高，且隨著RMP作用劑量的增大，逐步升高。100 μg/mL的RMP處理12 h，線粒體中細胞色素C的相對質量分數為(55.53±3.24)%，胞漿中則為(45.39±4.09)%。200 μg/mL的RMP處理12 h，線粒體中細胞色素C的相對質量分數為(43.13±3.89)%，胞漿中則為(96.98±5.51)%，與100 μg/mL處理組呈現顯著性差異，結果表明細胞色素C從Hela細胞線粒體中釋放而進入胞漿。

圖6 RMP誘導Hela細胞中細胞色素C的釋放

2.5.3 RMP對Caspase表達活性的影響

如圖7所示，RMP的處理使得Hela細胞中Caspase表達活性顯著升高，低質量濃度的RMP(50 μg/mL)處理12 h，Caspase-9的表達活性達到對照組的(172.26±4.68)%，Caspase-3則為(185.35±6.36)%。RMP作用濃度升高，Caspase表達活性也顯著升高，200 μg/mL的RMP對應的Caspase-9為(247.62±5.66)%，Caspase-3則為(255.39±6.02)%。

圖7 RMP對Hela細胞Caspase-9和-3活性的影響

3 討論

3.1 菜籽餅粕多肽的制備

目前，以菜籽餅粕或菜籽蛋白為原料獲得菜籽餅粕多肽的方法主要有酶法、化學法以及微生物發酵法，應用較廣泛的為酶解法制備菜籽餅粕多肽。酶解法反應條件溫和，有利于保持氨基酸的原有構型，但是蛋白酶具有底物專一性，因此，選擇合適的蛋白酶是酶法制備菜籽餅粕多肽的重要步驟。本研究中，選擇堿性蛋白酶Protex6L水解菜籽餅粕總蛋白制備多肽，最終得率接近35%。有報道，堿性蛋白酶Alcalase水解獲得多肽的得率為40%[13]，造成這種差異的原因可能在于菜籽餅粕自身蛋白質含量及酶解反應條件等。從菜籽餅粕總多肽中純化出單一多肽的方法多在探索階段，目前鮮有標準化流程化方法的報道。本研究中，依據分子量大小的分子排阻色譜和依據極性的反向高效液相色譜進行聯用，純化出RMP，這在天然植物多肽的純化上應用較廣[14]，但在菜籽餅粕多肽上的應用則較少。此外，菜籽餅粕蛋白水解后的總多肽種類很多，其相對分子質量及結構存在差異，如何能高效分離純化菜籽餅粕多肽是今后研究的重點。

3.2 RMP對Hela細胞的抑制作用

已有研究表明，在細胞凋亡的后期，DNA被降解成大小多為180～200 bp的片段，并且許多3′-OH末端被暴露出來，可以通過與某些特定的染料(如FITC)結合來檢測細胞凋亡[15, 16]。因此，本研究中首先通過TUNEL染色來確定Hela細胞的狀態，RMP的處理能夠誘導Hela細胞凋亡，說明RMP抗腫瘤的活性是借助于誘導細胞凋亡實現的。

3.3 RMP誘導凋亡的作用機制探索

研究表明，在不同因素誘導的細胞凋亡中，線粒體膜電位會隨著細胞形態的改變而降低，甚至在細胞形態改變之前也會降低[17, 18]。線粒體膜電位的降低常常伴隨著細胞色素C的釋放，而細胞色素C從線粒體釋放到胞漿，是線粒體啟動凋亡程序的關鍵步驟之一[19]。許多研究已經報道，某些天然產物可以通過促進細胞色素C的釋放來促進腫瘤細胞凋亡。黑木耳(Auriculariaauricular)多糖可以促進細胞色素C釋放，誘導人肝癌細胞凋亡[20]。目前，就菜籽餅粕多肽的抗腫瘤活性更多的集中于增強機體免疫力方面的研究，具體的作用通路尚不明了[21]。

研究證實，Caspases在細胞凋亡過程中起著重要作用。細胞凋亡可以認為是一種Caspases對底物進行不可逆的有限水解的級聯放大反應過程。早期的研究表明，線粒體釋放的細胞色素C與Caspase-9的前體結合，觸發其活性[22]。激活的Caspase-9(啟動子Caspase)能觸發Caspase-3(效應子Caspase)，Caspase-3通過水解Caspase靶蛋白引起細胞凋亡[23]。本研究中，RMP能夠促進Caspase-9和-3的活性，實現Hela細胞的凋亡。

4 結論

通過分子排阻色譜和反向高效液相色譜法從菜籽餅粕中分離純化出小分子多肽(RMP)并驗證了RMP的抗腫瘤活性。RMP相對分子質量為886 u，由8個氨基酸組成，序列為Asp-Val-Phe-Val-Pro-Pro-Val-Leu，RMP結構簡單，易于人工合成。分子排阻色譜和反向高效液相色譜法連用能夠為菜籽餅粕多肽的分離純化提供一種參考方法。抗腫瘤細胞實驗證明，RMP能通過線粒體依賴途徑誘導Hela細胞的凋亡，即降低Hela細胞線粒體膜電位，促進細胞色素C從線粒體到胞漿的釋放，進而激活Caspase蛋白，執行細胞凋亡。因此，RMP有望作為一種抗腫瘤活性物質在腫瘤預防和治療的保健品和藥品中發揮作用。