響應曲面法優(yōu)化白花前胡總香豆素提取及抑菌和抗氧化活性

史 娟， 葛紅光， 郭少波， 朱 斌， 鄭錦麗

(陜西省催化重點實驗室，陜西理工大學化學與環(huán)境科學學院，漢中 723000)

高頻率、大劑量抗菌藥物的長期使用以及藥劑新品種缺乏所導致的細菌、真菌的耐藥現(xiàn)象近年來不斷發(fā)生，農(nóng)作物病菌性危害已成為影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要病害之一，對作物產(chǎn)量和品質(zhì)造成了較大影響。馬吳杰等[1]采用菌絲生長速率法對河北、內(nèi)蒙古等地區(qū)采集分離的馬鈴薯晚疫病菌菌株檢測發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺的敏感性趨于下降，普遍產(chǎn)生低水平抗性，平均抗性倍數(shù)為3.45，平均抗性指數(shù)為0.48；所有供試菌株中抗性菌株頻率占90.80%，其中低抗菌株占90.35%。尋找開發(fā)廣譜、高效、安全、低廉且抑菌性能較好的天然抗菌劑成為農(nóng)作物病害防治的重點。香豆素具有順式鄰位羥基肉桂酸的內(nèi)酯結構，是植物次生代謝產(chǎn)物，因其結構、藥用作用點特殊，環(huán)境友好等優(yōu)點，在農(nóng)藥先導分子的開發(fā)中發(fā)揮了重要作用。如簡單蛇床子素作為一種殺蟲抑菌的生物農(nóng)藥已被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)；含有香豆素母核的東莨菪素、濱蒿內(nèi)酯、花椒毒素、補骨脂素和秦皮乙素等可有效抑制或殺滅耐藥菌；引入吡唑、咪唑雜環(huán)的香豆素衍生物可進一步增強抗菌活性和廣譜性[2]。近年來，香豆素類物質(zhì)還被報道具有清除自由基活性、抗氧化活性[3]，這為克服全球人口老齡化所產(chǎn)生的抗衰老生物學帶來了新的切入點。目前，植物源香豆素多采用傳統(tǒng)溶劑提取法、超臨界流體提取法、微波提取法及超聲波提取法等。溶劑提取法操作簡單、成本低，但提取時間長、溶劑用量大，且有機殘留多、雜質(zhì)多；超聲波輔助萃取法操作簡單、低溫提取、提取物活性高、提取率高，但提取量小[4]。

前胡為傘形科植物白花前胡(PeucedanumpraeruptorumDunn)的干燥根，在我國山東、陜西、安徽、江蘇等省分布較廣，具有化痰降氣、祛風解熱等功效。現(xiàn)代藥理學研究表明，前胡具有鎮(zhèn)咳、祛痰[5]、神經(jīng)保護[6]、降糖、降壓、抗氧化及抗癌等作用[7]。目前白花前胡的研究工作多集中在前胡化學成分分析、鑒定及其對小鼠心肺功能藥理活性[8-10]。如汪康等[9]從白花前胡中分離得到異紫花前胡內(nèi)酯(Nodakenetin)、噢洛內(nèi)酯(Oroselol)、紫花前胡素D、Pd-C-Ⅱ、Marmesin-11-O-β-D- glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside等5個化合物；周曉霞等[10]研究發(fā)現(xiàn)白花前胡有效成分Pd-Ia可明顯減輕急性肺損傷肺部的炎癥反應。而對有效成分總香豆素的優(yōu)化提取和抑菌、抗氧化活性研究較少[11-13]。本研究嘗試利用超聲預處理-乙醇回流法提高香豆素收率，響應面實驗獲得白花前胡總香豆素最佳提取工藝條件，并對純化后的香豆素進行植物病原菌及多種自由基的抑制實驗，以期為白花前胡在功能食品、保健品領域的應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白花前胡；4-羥基香豆素(純度≥98%)；葡萄糖、瓊脂、酵母浸粉、胰蛋白胨均為分析純;實驗用水為蒸餾水。

馬鈴薯干腐病菌標準菌株(Fusariumsulphureum,F.s.)、番茄灰霉病菌標準菌株(Botrytiscinerea,B.c.)、尖孢鐮刀病菌標準菌株(Fusariumoxysporum,F.o.)、蘋果炭疽病菌標準菌株(Colletotrichumgloeosporioide,C.g.)、水稻稻瘟病菌標準菌株(PyriculariaGrisea,P.g.)、蘋果腐爛病菌標準菌株(Cytosporasp,C.s.)，由陜西理工大學生物科學與工程學院微生物實驗室提供，2～8 ℃冷藏保存。

SB3200DTDN型超聲波清洗機，RE52-9型旋轉蒸發(fā)器，AR124CN型電子天平，LD4-2A(Ⅱ)型離心機，DGG-9140B型電熱恒溫鼓風干燥箱，UV-2600型紫外分光光度計，ZHJH-C1112B型智城超凈工作臺，MGC-P光照培養(yǎng)箱，LDZF-75L立式高壓蒸汽滅菌器。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取及含量計算

精確稱取4-羥基香豆素10 mg，以無水乙醇為溶劑配制0.1 mg/mL香豆素標準溶液，再將其稀釋得到一定濃度梯度的系列標品溶液，320 nm下測定各濃度的吸光值。以標準品濃度X為橫坐標，吸光值Y為縱坐標，繪制標準曲線后得到回歸方程：Y=0.022 09X+1.966 52，r2=0.993 2。

白花前胡洗凈，真空干燥，粉碎，過20目篩，石油醚回流脫脂后的粉末加入一定體積乙醇溶液，在水浴溫度50 ℃，功率250 W、振動頻率40 kHz條件下超聲波處理30 min，繼續(xù)在一定溫度下提取一定時間后，過濾得到白花前胡總香豆素的提取液。按照回歸方程測試范圍對提取液進行稀釋，由吸光度求出提取液中的總香豆素質(zhì)量濃度，并按公式計算白花前胡香豆素提取率。每個實驗平行3次，取平均值。

式中：C為從線性回歸方程中求出的白花前胡香豆素質(zhì)量濃度/mg/mL，V為提取液體積/mL，n為測試稀釋倍數(shù)，m為原料前胡的質(zhì)量/g。

1.2.2 單因素實驗

提取時間對提取率的影響：準確稱取2.0 g脫脂前胡粉末，按料液比1∶40 g/mL，加入體積分數(shù)為60%的乙醇溶液80 mL，超聲處理后，在提取溫度為80 ℃條件下，改變提取時間為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h，考察提取時間對提取率的影響。

乙醇體積分數(shù)對提取率的影響：固定料液比1∶40 g/mL，提取溫度80 ℃，提取時間2 h，改變乙醇體積分數(shù)為50%、60%、70%、80%和90%，研究乙醇體積分數(shù)對提取率的影響。

料液比對提取率的影響：以60%乙醇溶液做溶劑，提取溫度80 ℃，提取時間2 h，考察料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60 g/mL下香豆素的提取率。

提取溫度對提取率的影響：60%乙醇溶液為提取溶劑，料液比1∶40 g/mL，提取時間為2 h，考察提取溫度分別為50、60、70、80和90 ℃下香豆素的提取率。

1.2.3響應面實驗設計

表1 響應面分析因素與水平表

在單因素實驗基礎上，按照Box-Behnken設計原理，選擇提取時間、乙醇體積分數(shù)、液料比和提取溫度為自變量，以前胡總香豆素提取率為響應值，利用Design-Expert 8.0.5軟件進行響應曲面分析優(yōu)化提取條件，響應面實驗因素編碼及水平設計見表1。

1.2.4 香豆素的純化

將所得白花前胡提取液65 ℃減壓旋蒸濃縮，得到棕褐色黏稠狀膏體，加入少量中性氧化鋁粉末拌均勻，烘干，進行硅膠柱層析[11, 12]。先后用石油醚、乙酸乙酯及65%甲醇和水進行洗脫。將甲醇洗脫液合并，濃縮得到淡黃色粉末。

1.2.5 抑菌活性研究

1.2.5.1 供試菌株的活化及平板涂布培養(yǎng)

在121 ℃、0.1～0.15 MPa、30 min條件下高壓滅菌，將冰箱冷藏保存的馬鈴薯干腐病菌(F.s.)、番茄灰霉病菌(B.c.)、尖孢鐮刀病菌(F.o.)、蘋果炭疽病菌(C.g.)、水稻稻瘟病菌(P.g.)和蘋果腐爛病菌(C.s.)6種植物病菌的標準菌株在馬鈴薯培養(yǎng)基上劃線接種，28 ℃下置于培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)，活化7 d后備用。

采用菌絲生長抑制法測定白花前胡香豆素在50 mg/mL下對1.2.5.1所述6種植物病菌的抑制活性測試。

稱取純化后白花前胡香豆素0.05 g，將其用丙酮溶解后倒入一定體積的馬鈴薯培養(yǎng)基中混合，得到質(zhì)量濃度50 mg/mL的帶藥培養(yǎng)基，趁熱倒板。待培養(yǎng)基凝固后，用已干燥滅菌直徑為6 mm開孔器于活化好的真菌培養(yǎng)基上打孔，無菌鑷子夾取菌餅置于含樣平板呈“品”字擺放，所有實驗平行進行3次，并用相同體積溶劑丙酮做空白對照。所有含菌平板放置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，取出平板后采用十字交叉法測量菌圈直徑大小。

1.2.5.3 IC50測定

參照文獻[13]方法使用質(zhì)量濃度倍減法將供試白花前胡香豆素用溶劑溶解后制備100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL梯度的帶藥培養(yǎng)基，以溶劑丙酮為空白對照，按照1.2.5.2實驗步驟，得到各質(zhì)量濃度下真菌的菌圈直徑，并按公式計算抑制率。

抑菌率=(A-B)/(A-6)×100%

式中：A代表空白對照組的菌圈直徑；B代表樣品的菌圈直徑。

1.2.6 抗氧化活性研究

狗可以不懂事，人必須明事理。依法養(yǎng)犬，文明養(yǎng)犬，是每個養(yǎng)犬人的義務。從現(xiàn)實來看，大多數(shù)養(yǎng)狗之人也是愛狗之人，日常能夠做到文明養(yǎng)犬。但也有一些養(yǎng)狗人只圖自己開心方便，無視公共利益和他人權益。他們或認為自家愛犬聽話、不會咬人，或認為拴狗繩對狗健康不利，或認為犬只隨地便溺反正有環(huán)衛(wèi)工人清掃，何必污了自己的手。如此一來，勢必將自己的愛犬置于矛盾的焦點，不僅是對愛犬的不負責任，也會影響所有愛狗人士的形象。

1.2.6.1 清除DPPH自由基活性的測定

參考文獻方法[14]，將2 mL香豆素乙醇溶液與2 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L)加入10 mL試管中，振搖均勻后室溫避光30 min，517 nm處測量吸光度值，記為Ax；同時，測定2 mL DPPH+ 2 mL乙醇吸光度，記為A0；測定2 mL香豆素乙醇溶液+2 mL乙醇吸光度，記為Ai。按清除率=[1-(Ax-Ai)/A0]×100%，計算不同濃度香豆素溶液對DPPH自由基的清除率。再以香豆素乙醇溶液濃度為橫坐標，清除率為縱坐標繪制濃度-抑制率圖形。

1.2.6.2 清除羥基自由基( OH-·)活性的測定

利用Fenton反應原理，將濃度為6 mmol/L FeSO4溶液3 mL、6 mmol/l水楊酸溶液3 mL及1 mL香豆素乙醇溶液、6 mmol/L H2O2溶液3 mL，依次加入25 mL容量瓶，定容，搖勻后靜置。510 nm下測其吸光度，記為Ax。同上步驟，以等體積水代替6 mmol/L水楊酸溶液測定吸光度，記為Ai；再以乙醇代替香豆素溶液測得空白對照吸光度，記為A0，采用1.2.6.1公式計算得到不同濃度香豆素溶液對羥基自由基的清除率，并繪圖。

在325 nm下測定0.5 mL鄰苯三酚+4.5 mL磷酸鹽+鹽酸混合溶液的吸光度，記為A0；4.5 mL磷酸鹽+0.1 mL樣品+0.4 mL鄰苯三酚+鹽酸混合溶液的吸光度，記為Ax；4.9 mL磷酸鹽+0.1 mL樣品+鹽酸混合溶液的吸光度，記為Ai。采用1.2.6.1公式計算得到不同濃度香豆素溶液對羥基自由基的清除率，并繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

提取時間、乙醇體積分數(shù)、液料比和提取溫度對白花前胡總香豆素提取的影響如圖1所示。

觀察圖1中提取時間變化對香豆素提取率的影響發(fā)現(xiàn)，0.5～2.0 h范圍內(nèi)，前胡香豆素提取率隨提取時間延長而不斷增大。這是因為香豆素分子剛性較強，溶解度較小，增加提取時間有利于藥材粉末與提取溶劑的充分接觸，使得香豆素溶出更為充分。提取時間達到2 h時，香豆素提取率達到最高值1.51%；繼續(xù)增加提取時間，提取率出現(xiàn)了小幅降低，這可能與過長時間加熱所導致的物質(zhì)結構破壞及雜質(zhì)析出增加有關，故最佳提取時間選擇2.0 h為宜。

圖1亦反映了乙醇提積分數(shù)對提取率的影響。相同條件下以60%乙醇作為提取溶劑時，香豆素提取率可達最高值1.71%。這是因為香豆素在乙醇中的溶解度大，在水中溶解度小，乙醇濃度升高，有利于香豆素的溶出。但乙醇質(zhì)量濃度大于60%后，香豆素提取率不增反降，這是因為乙醇濃度過高，易導致前胡所含其他脂溶性成分與乙醇-水分子結合，從而與香豆素形成溶出競爭關系，導致香豆素提取率降低。因此選60%乙醇作為最佳提取溶劑。

圖1中反映料液比對提取率影響關系的曲線中，所示的料液比越小，意味著使用相同質(zhì)量的前胡提取香豆素時，所加入的溶劑就越多。提取溶劑體積增大，有利于前胡粉末的充分浸潤，可以有效地提高香豆素的提取率。但溶劑量使用過大不僅帶來實驗的高成本，還會因為溶劑中水量過高造成香豆素溶出受阻，且水溶性蛋白、多糖等雜質(zhì)附帶析出，會對測試帶來較大干擾，因此選擇最優(yōu)料液比為1∶40 g/mL。

在圖1所示50 ℃至80 ℃的溫度范圍，香豆素提取率逐漸增高。當溫度升至80 ℃時，提取率達到最大值。這是因為植物細胞在較高溫度時容易破裂，且溫度升高分子運動加速，可以促進前胡香豆素的有效溶出。但溫度大于80 ℃易造成香豆素結構受到破壞，提取率反而下降，故最佳提取溫度應為80 ℃。

圖1 不同因素對白花前胡香豆素提取率的影響

2.2 響應面法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 響應面實驗結果

分析表2實驗結果，得到回歸方程。

Y= 4.23-0.0003A-0.028B-0.0064C+0.066D+0.017AB-0.041AC-0.032AD+0.005BC-0.010BD-0.010CD- 0.15A2-0.13B2-0.23C2-0.33D2。

表2 響應面實驗設計及結果

2.2.2 響應面結果分析

此外，表3中的一次項D(提取溫度)，二次項A2、B2、C2、D2對響應值影響極顯著(P<0.01)；一次項B(乙醇體積分數(shù))、交互項AC對響應值影響顯著(P<0.05)；其余A(提取時間)、B(乙醇體積分數(shù))和C(料液比)、交互項AB、AD、BC、BD、CD各項對提取率的影響均不顯著。繼續(xù)比較F值，可知各因素對響應值影響力度為：D>B>C>A。

表3 回歸方程模型及方差分析

2.2.3 響應曲面分析及提取工藝優(yōu)化

Design-Expert 8.0.6軟件對所得提取數(shù)據(jù)進行解析，可得到超聲輔助提取白花前胡總香豆素三維響應圖，分析發(fā)現(xiàn)，提取溶劑乙醇的體積分數(shù)和提取溫度固定零水平時，隨著提取時間延長和料液比降低，香豆素提取率有較為明顯的增加，在響應面變曲線上呈現(xiàn)出了坡度較陡的現(xiàn)象；同時等高線趨向呈橢圓形，這說明提取時間和料液比的交互作用顯著[15]。

在此基礎上，通過Design-Expert 8.0.6軟件求解方程，對回歸方程進行分析處理，獲得超聲輔助提取白花前胡總香豆素的最優(yōu)提取工藝為：回流時間為1.99 h、乙醇濃度58.86%、料液比1∶39.84 g/mL、回流溫度81.04 ℃，此條件下，白花前胡總香豆素提取率的理論預測值為4.237%。為驗證響應面法所得結果的可靠性，兼顧實際操作可行性，將最佳提取工藝參數(shù)修正為：回流時間2 h、乙醇濃度59%、料液比1∶40 g/mL、回流溫度81 ℃，在優(yōu)化條件下重復實驗3次，實際測得的白花前胡總香豆素平均提取率為(4.249±0.03)%，與預測值基本吻合，進一步驗證了該理論模型的可行性，也說明由該模型優(yōu)化得出的最佳工藝對于超聲預處理-乙醇回流法提取白花前胡香豆素的工藝具有實際應用價值。

2.3 白花前胡總香豆素抑菌活性

2.3.1 藥敏實驗結果

表4為用菌絲生長抑制法所測定的白花前胡香豆素在50 mg/mL下對6種植物病菌的抑制結果。實驗組菌圈代表了真菌菌餅在含有香豆素的帶藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后的情況，實驗組菌圈直徑越小，空白組菌圈圈越大，表示白花前胡香豆素對真菌的抑制率越強。表4直觀給出的結果是白花前胡香豆素對馬鈴薯干腐菌和水稻稻瘟菌的菌絲生長抑制效果較好，而對尖孢鐮刀菌抑制效果較差。

表4 前胡總香豆素對植物真菌的抑菌圈直徑

2.3.2 抑菌率測定結果

圖2表明前胡香豆素對6種供試植物病菌均具有抑菌作用，且抑菌效果與香豆素濃度呈現(xiàn)顯著量效關系。前胡香豆素對馬鈴薯干腐病菌、蘋果炭疽病菌和水稻稻瘟病菌為抑制較優(yōu)組，在最高質(zhì)量濃度下(200 mg/mL)，抑制率分別達到97.5%、94.8%和99.4%。其中，馬鈴薯干腐菌和水稻稻瘟菌最低抑菌濃度(MIC)均為3.125 mg/mL，蘋果炭疽病菌MIC為6.25 mg/mL。蘋果腐爛病菌和番茄灰霉病菌為抑制中等組，最高濃度時，抑菌率保持在73.5%和70.5%，香豆素對2種菌的MIC為6.25 mg/mL；尖孢鐮刀菌抑制率最低，最高值抑制率僅為28.3%，MIC為12.5 mg/mL。

圖2 前胡香豆素對植物真菌的抑菌率

2.4 白花前胡總香豆素的抗氧化作用

圖3～圖5為前胡香豆素對DPPH自由基、超氧自由基和羥基自由基的清除活性測試結果。前胡香豆素對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基存在不同程度的清除活性，且活性指標隨香豆素濃度增加而增強，與樣品濃度存在量效關系。同一濃度時，前胡香豆素對3種自由基清除率次序為：羥基自由基>超氧陰離子自由基>DPPH自由基。前胡香豆素對羥基自由基清除活性最好，在質(zhì)量濃度達到0.1 mg/mL后，抑制率可以達到78%以上，與VC清除能力接近。這是因為香豆素分子所含酚羥基與黃酮酚羥基類似，因其自身具有提供氫原子的能力，故可有效參與引起生命體衰老的自由基鏈反應[16]，從而發(fā)揮阻斷生命體自由基鏈反應的作用。

圖3 前胡香豆素對DPPH自由基的清除活性

圖4 前胡香豆素對超氧自由基的清除活性

圖5 前胡香豆素對羥基自由基的清除活性

3 結論

本實驗以乙醇溶液為溶劑，超聲預處理-乙醇回流法得到白花前胡所含總香豆素，在單因素實驗基礎上，通過響應面法確定了最佳提取工藝條件。結果表明在回流時間2 h、乙醇體積分數(shù)59%、料液比1∶40 g/mL、回流溫度81 ℃條件下白花前胡香豆素提取率最高為(4.249±0.03)%。白花前胡香豆素具有良好的抑菌能力和抗氧化，可有效抑制六種測試植物真菌的生長，活性順序為：水稻稻瘟菌>馬鈴薯干腐菌>蘋果炭疽菌>蘋果腐爛菌>番茄灰霉菌>尖孢鐮刀菌，白花前胡香豆素對水稻稻瘟菌和馬鈴薯干腐菌MIC為3.125 mg/mL；對蘋果炭疽菌、蘋果腐爛菌和番茄灰霉菌MIC為6.25 mg/mL；對尖孢鐮刀菌的MIC最大，為12.5 mg/mL。總香豆素對三種測試自由基清除活性次序為：羥基自由基>超氧自由基>DPPH自由基，氧化抑制率隨香豆素濃度的增大逐漸增高。