流式細胞術在本科實驗教學中的應用

吳映霞，陳笑霞，孫彩云，何祖勇，張楚英，張 雁

（中山大學生命科學學院，廣州 510275）

0 引言

流式細胞術是當今生命科學研究過程中非常重要的一種檢測方法，已經廣泛應用于細胞生物學、免疫學、血液學、醫學、腫瘤學、生理學、遺傳學、藥學和微生物學等多個學科專業。流式細胞術是能夠在非常短的時間內分析大量單個細胞的多種特征，同時分選靶細胞的高新技術［1-3］。凡是對流式細胞術的應用都離不開流式細胞儀，而流式細胞儀是指高速流動的細胞或者生物顆粒在激光的照射下，發射出散色光和熒光信號，并將這些光信號轉換成電信號，再進一步轉換成數字信息，從而分析出細胞或顆粒的物理屬性和化學屬性，同時還可以分選出靶細胞的儀器。在Medline 數據庫中，從1970 年開始，有關流式細胞儀發表的文章呈指數增長，研究范圍非常廣泛［4］。

隨著國家不斷加大對高校科研和教學的投入，流式細胞儀等大型精密高端儀器為高校科研水平和綜合實力的提升發揮了重要作用［5-6］。而掌握一門像流式細胞術這樣的高端先進技術，在當今激烈的科研和就業競爭中越來越重要［7］。流式細胞儀由于其構造精密、操作復雜、價格昂貴，目前主要是用于科研［8］，并且由專門技術員或者研究生使用，本科生很難或者很少有機會操作這些大型貴重儀器［9-10］。這也是目前我國高校普遍存在的現象，大型精密儀器主要用在科研上，在本科教學中較少發揮作用，本科生對流式細胞儀知之甚少。這種現象在國外也存在［7］，像流式細胞術這種強大的分析技術，沒有經過專業的培訓，本科生要么不會使用，要么使用不當，從而阻礙了研究的進展，因此，現在很多高校把為本科生設置學習先進技術的課程，作為主要目標［11-13］。

生物科學綜合實驗是現代生命科學一門非常重要的綜合性生物技能大型專業實驗課程，對提高學生的生物實驗技能和綜合素質非常重要。為了向本科生普及流式細胞術的知識，學習不同學科技術，提高科研能力，同時針對大型精密儀器在本科教學中使用率低的問題，自2017 年起，對生物科學綜合實驗課程進行教學改革，引入流式細胞術，通過編寫流式相關講義、設計實驗方案和操作步驟，對脂質體介導的細胞瞬時轉染技術實驗項目的實驗手段予以補充和豐富。這樣既可開拓學生的視野，又具有創新性，還能讓學生掌握新的研究方法與技術。

下面以脂質體介導的細胞瞬時轉染技術實驗項目的教學為例，詳細說明流式細胞術在生物科學綜合實驗教學中的應用。

1 流式細胞儀的工作原理

在運用流體動力學設計的流動室里，樣本在鞘液的包裹下，恒定的處于液流的中心位置，并且以單個細胞排列依次經過檢測點，在激光的激發下，發射出不同的散射光（前向散射光FSC 和側向散射光SSC）和熒光，這些光信號分別被不同的探測器接收并轉換成電信號，電信號再轉換為可識別的數字信息，經過電腦分析處理后形成流式圖表，儲存在電腦上以供分析，同時如果需要分選靶細胞，則依據分選決策，使帶有靶細胞的液滴充上電荷，通過電極偏轉板時，帶不同電荷的液滴會發生吸引或排斥，進入適當的接收管中，從而分選出靶細胞。流式細胞儀的工作原理如圖1 所示。

圖1 流式細胞儀工作原理

從其工作原理中可見，流式細胞儀主要包括4 部分：①液流系統。將單個細胞依次排列送到激光照射區。②光學系統。產生并收集光信號。③信號處理系統。將光信號轉換成電信號，再轉換成數字化信息。④分選系統。給帶有靶細胞的液滴充電，分選收集靶細胞。液流系統、光學系統和信號處理系統是每臺流式細胞儀的基本組成部分，而分選系統則是具有分選功能的流式細胞儀才有。實驗使用的流式細胞儀型號是BD Accuri C5，只有一個488 nm 激光器，不具有分選功能。

2 教學與實驗方案設計

制作1 h的講義，講義涉及的內容有流式細胞術的原理、流式細胞儀組成部分及其作用、應用領域、常見名詞解釋和流式結果分析［14］。實驗方案則在原來的生物科學綜合實驗中的脂質體介導的細胞瞬時轉染技術基礎上，增加使用流式細胞儀檢測轉染效率，全班分成若干小組，每組有3 個樣品，分別是沒有加入脂質體轉染pmaxGFP 質粒的細胞（空白對照樣品）、加入7.5 μL 脂質體轉染pmaxGFP 質粒的細胞（低濃度樣品）和加入15 μL 脂質體轉染pmaxGFP 質粒的細胞（高濃度樣品），這3 個樣品先在倒置熒光顯微鏡中拍照觀察并計算轉染效率，再制備成單細胞懸液，通過流式細胞儀檢測轉染效率，最后比較這兩種檢測方法的差異。結合脂質體介導的細胞瞬時轉染技術的教學內容，從細胞復蘇開始，全部由學生自己動手操作。在操作儀器之前，老師首先向學生展示流式細胞儀的實體組成部分，接著由老師演示儀器的操作以及注意事項，最后每組的學生自己動手操作。上樣過程中，實時教學生如何分析實驗結果。實驗結束后，學生自己在軟件上分析原始數據，最后生成實驗報告。

3 材料與方法

3.1 材料

CHO細胞 不加脂質體轉染pmaxGFP 質粒的細胞（空白對照樣品）、加入7.5 μL 脂質體轉染pmaxGFP質粒的細胞（低濃度樣品）、加入15 μL脂質體轉染pmaxGFP質粒的細胞（高濃度樣品），每組細胞所轉染的pmaxGFP質粒為5 μg。

試劑 0.25%胰蛋白酶、DMEM 培養基、OPTIMEM? Reduced-Serum 培養基、胎牛血清、1 ×PBS。

設備 BD Accuri C5 流式細胞儀、倒置熒光顯微鏡、CO2培養箱、超凈工作臺、臺式低速自動平衡離心機、移液器。

3.2 方法

3.2.1 脂質體介導法將pmaxGFP質粒轉染細胞

脂質體介導法轉染pmaxGFP 質粒的方法按LipofectamineTM3 000 轉染試劑盒（Invitrogen，美國）的說明書進行。

3.2.2 在倒置熒光顯微鏡下觀察pmaxGFP 質粒的表達情況

將各組細胞培養皿置于倒置熒光顯微鏡下觀察，選擇至少3 個視野拍照，觀察每個視野下細胞的形態、熒光分布和強度等，并計數每個視野下細胞總數和轉入pmaxGFP質粒而表達綠色熒光的細胞數，計算轉染效率（熒光細胞／細胞總數），比較不同處理組之間的轉染效率。

3.2.3 用流式細胞儀檢測細胞轉染pmaxGFP 質粒的轉染效率

（1）在顯微鏡下拍照后的細胞，將培養基吸走，再用2 mL的1 ×PBS洗兩次，洗掉殘留的培養基。

（2）在60 mm的培養皿中加入0.5 mL 0.25%的胰蛋白酶，37 ℃孵育3 min，然后用移液器將細胞輕輕吹散，再加入0.5 mL 10%FBS，使胰蛋白酶失活。

（3）將細胞懸液移入裝有4 mL DMEM 培養基的15 mL離心管中，以200g速度離心5 min收集細胞，棄上清液，用3 mL 1 ×PBS重懸細胞，用移液器輕輕分散細胞20～30 次。

（4）將細胞懸液轉移到裝有細胞過濾器的5 mL流式管中，準備上樣。

（5）在BD Accuri C5 流式細胞儀的操作軟件上，先畫出FSC＆SSC點圖，橫縱坐標采用線性放大模式；接著畫GFP＆SSC點圖，橫坐標GFP 采用對數放大模式；最后畫GFP單參數直方圖。

（6）根據軟件設置，在96 孔樣本板上每一個孔代表一個樣品，點擊每個樣品孔，命名，再點擊RUN 上樣，設置上樣條件，記錄20 000 個P1 門中的細胞。

（7）樣品上完后，可從軟件的分析面板和統計面板中得到統計結果。

4 結果與分析

pmaxGFP質粒攜帶綠色熒光蛋白GFP，GFP 在488 nm 藍光激發下，會發射出530 nm 左右的綠色熒光，在常規的倒置熒光顯微鏡下便可觀察到轉染GFP質粒的細胞。本實驗以脂質體介導法將pmaxGFP 質粒轉入細胞中，在倒置熒光顯微鏡中初步觀察的結果（以其中一組學生結果為例）如圖2 所示，空白對照樣品的細胞沒有表達綠色熒光蛋白［見圖2（a）］，低濃度樣品［見圖2（b）］和高濃度樣品［見圖2（c）］轉染pmaxGFP質粒后的陽性細胞呈綠色，低濃度樣品的陽性細胞數目比高濃度樣品的多，熒光亮度也較強。說明不加脂質體，pmaxGFP 質粒不能進入細胞，加脂質體時，并非脂質體的濃度越高轉染效率越高，選擇合適濃度的脂質體才能獲得最高的轉染效率。

圖2 倒置熒光顯微鏡下觀察GFP在細胞中的表達情況

同樣在流式細胞儀488 nm藍光激發下，GFP能夠發射出530 nm左右的綠光，本實驗流式細胞儀檢測細胞轉染效率的結果如圖3 和表1 所示。

FSC-A ＆ SSC-A是散射光點圖［見圖3（a）］，通過這個圖先初步選擇目標細胞群，再根據FSC-A ＆Width［見圖3（b）］和SSC-A ＆ Width［見圖3（c）］選擇大小均一、顆粒度均一的目標細胞，最后再通過GFP直方圖［見圖3（d）］來分析陽性細胞的熒光強度。還可以通過在GFP直方圖中疊加各個樣品（見圖4），從而更清晰地展示樣品之間的差異。流式細胞儀能夠自動統計每個樣品的相對平均熒光強度，如表1 所示，陽性細胞越亮，相對平均熒光強度越強。從流式結果中可以得到，低濃度樣品的熒光強度比高濃度樣品的高，轉染效率也較之高。通過流式細胞儀檢測和倒置熒光顯微鏡觀察的細胞轉染效率結果是一致的，低濃度樣品轉入pmaxGFP 質粒的細胞比高濃度樣品的效率要高。從這兩種檢測方法中可以看出，流式細胞儀檢測細胞轉染效率的結果要比顯微鏡觀察記錄的結果誤差更低、更精確可靠、耗時更短。兩種檢測方法相結合，使該實驗項目內容更豐富，實驗結果更嚴謹。

圖4 各樣品中GFP對比圖

表1 流式細胞儀檢測樣品中GFP相對熒光強度

圖3 流式細胞儀檢測GFP在細胞中的轉染效率

把流式細胞術引入到生物科學綜合實驗課程的本科實驗教學中，采用理論與實踐相結合的方式，學生通過先了解學習流式細胞術的基本知識，對流式細胞儀產生濃厚的興趣，再通過制備流式樣品、觀察儀器構造、操作儀器、分析實驗結果等，來加深對流式細胞術的認識。這樣的教學方式，充分調動學生的積極性和主動性，增強本科生動手能力，培養本科生的科研思維和分析能力，教學效果更顯著。學生經過此次教改實驗，從對“流式”一無所知，到了解流式細胞儀如何對單個細胞進行定量或定性分析，不僅學會了流式細胞術的原理和基本操作流程，還掌握了制備流式樣品和分析結果的能力，學生們表示受益匪淺，對以后獨立設計實驗和提高科研分析能力都有很大的幫助。

5 結語

流式細胞術能夠對細胞進行定量或定性分析，在非常短的時間內能夠檢測大量細胞，且能夠同時分析單個細胞的多種特性，是一種多功能、高通量、快速有效的生物檢測技術。實踐表明，在本科生的實驗教學中傳授流式細胞術知識，學生不僅能夠綜合運用多種實驗技術，又可以使本科生了解更多新知識、新視野、新技術，同時培養了學生創新的科學素養，提高了課程的挑戰度，為研究性教學提供新思路。另外，除了能提高本科生學習新技術的積極性和主動性以外，還能使大型精密貴重儀器的使用率增加。在以后的教學實踐中，還盡可能將其他大型精密儀器開放給本科生學習使用，讓本科生為將來的科研工作做好準備。