貴州喀斯特山區(qū)野生葛藤根瘤菌的資源利用

吉玉玉，曾慶飛，王海瑾，王佳楚函，歐二綾，韋興迪，韋 鑫，龍忠富

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴陽 550006；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550006)

中國是世界上喀斯特地貌分布最廣的國家之一，大陸上裸露、半裸露及埋于地下的碳酸鹽巖分布面積約占全國總面積的三分之一，是我國亟需治理的生態(tài)脆弱區(qū)之一。

貴州省地處中國西部山區(qū)高原與東部丘陵平原之間的過渡區(qū)域，屬于典型的喀斯特地貌[3]，是中國西南地區(qū)喀斯特面積最大、生態(tài)環(huán)境最復(fù)雜的省份[4]。研究表明，加快草地建設(shè)是喀斯特地區(qū)解決生態(tài)退化的有效途徑[1]。喀斯特地區(qū)石漠化的本質(zhì)是土壤退化，氮素大量流失，植被恢復(fù)慢。豆科植物作為世界重要的飼草種類之一，在改善土壤理化性質(zhì)、提高土壤肥力等方面也占據(jù)重要地位，還可作為先鋒植物為其他植物定居提供必要生長條件，被廣泛用于生態(tài)恢復(fù)與重建[2]。豆科牧草野生葛藤(Puerarialobota)作為一種優(yōu)良的水土保持植物、飼草植物和藥用植物種質(zhì)資源，在貴州境內(nèi)廣為分布[5]，具有生長迅速、根深葉茂、固氮增肥、改良土質(zhì)等優(yōu)良特性[6]。

根瘤菌-豆科植物共生固氮系統(tǒng)是生物固氮的主要體系。葛藤以結(jié)瘤數(shù)高、固氮率高、固氮量多[7]等優(yōu)勢改善石漠化地區(qū)土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力[8]，用于荒山、荒灘改造和石漠化治理[9]，在修復(fù)污染退化土壤和植被生態(tài)的恢復(fù)等方面發(fā)揮巨大的作用[10-11]。目前國內(nèi)針對葛藤根瘤菌的研究多集中在其遺傳系統(tǒng)多樣性上，如謝徽[12]探討了四川攀枝花地區(qū)葛藤根瘤菌的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育地位；陳強等[13]證明了23株四川葛藤屬根瘤菌的遺傳特性存在明顯差異；魏世清[14]深入研究了葛藤根瘤菌的耐酸性等。貴州省內(nèi)關(guān)于葛藤主要集中在其作為飼用植物資源方面的研究[15]，而針對環(huán)境特殊且資源豐富的貴州野生葛藤共生根瘤菌的研究還很缺乏[16]。

本研究利用采自貴州省不同生態(tài)功能區(qū)域的野生葛藤根瘤菌進行序列比對以及區(qū)系分析，并通過盆栽實驗篩選出結(jié)瘤數(shù)多、固氮力強與促生效果優(yōu)良的根瘤菌株，為貴州喀斯特地區(qū)植被恢復(fù)提供優(yōu)異種質(zhì)資源，為石漠化治理提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)域與材料

1.1.1采集區(qū)域

樣品采集于貴州省16個縣(市)，遍布5個不同生態(tài)功能區(qū)[17]，不同生態(tài)區(qū)、采集地點及樣品編號見表1。共采集到25份野生葛藤根瘤樣品。

表1 樣品編號及采集地點概況

1.1.2實驗材料

百脈根“歌德”種子購于貴州省某園林綠化公司；細菌基因組DNA抽提試劑盒購于北京百泰克生物技術(shù)有限公司；

1.1.3培養(yǎng)基

本試驗對酵母甘露醇瓊脂(YMA)培養(yǎng)基進行了改良，改良后的YMA液體培養(yǎng)基為：甘露醇10 g，MgSO40.2 g，K2HPO40.25 g，KH2PO40.25 g，CaSO40.2 g，NaCl 0.1 g，酵母粉1 g，適量蒸餾水混合后，加配制好的Na2MoO4(1%)、MnSO4(1%)、檸檬酸鐵(1%)各1 mL，定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2。

分離純化所用固體培養(yǎng)基則是在改良YMA液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入瓊脂粉16～18 g，剛果紅(1%)2.5 mL混勻。

1.2 樣品處理及分離純化

樣品處理：沖洗葛藤根瘤樣品后無菌水浸泡過夜。挑選20～25顆單個根瘤依次用95%酒精、0.1% HgCl2浸泡5 min。

菌株分離：超凈工作臺內(nèi)取無菌水沖洗過的單個根瘤，于1 mL無菌水的研缽中研磨成懸濁液，涂布于YMA平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d，待出菌后每天觀察。

菌株純化：挑取單個菌落接種于新平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)直至形成單菌落，重復(fù)2～3次，染色鏡檢(革蘭氏染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司)，獲得純化菌株。

菌株保存：純化菌株接種至YMA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min 培養(yǎng)5～7 d后，30%甘油保種，-80 ℃凍存。

1.3 種類鑒定及區(qū)系分析

1.3.1形態(tài)學(xué)鑒定

鏡檢為紅色的革蘭氏陰性(G-)菌株，參照《微生物分類學(xué)》中鑒定方法[18]，觀察菌體形態(tài)特征。

1.3.2菌株16 S rRNA基因序列分析

細菌基因組試劑盒提取菌株總DNA，各菌株16 S rDNA采用通用引物進行PCR擴增，預(yù)變性、變性、退火、延伸的條件分別為：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s；54 ℃、1 min，72 ℃、2 min，35個循環(huán)；PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化回收后送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行測序。測序完成后，利用NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫、BLAST同源性比對，DNAMAN分析軟件多重比對，最終結(jié)合菌體形態(tài)鑒定結(jié)果，確定各菌株的種屬分類地位。

1.3.3區(qū)系分析

根據(jù)種類鑒定結(jié)果，系統(tǒng)分析調(diào)查區(qū)域內(nèi)葛藤根瘤菌的種類及分布情況。分布頻率采用相對頻率和發(fā)生頻率分別計算，計算公式：

相對頻率(%)=(有某菌種發(fā)生的樣品數(shù)/有菌種發(fā)生的總樣品數(shù))×100%；

發(fā)生頻率(%)=(有某菌種發(fā)生的菌株數(shù)/鑒定出的菌株總數(shù))×100%。

1.4 根瘤菌株的盆栽回接篩選

1.4.1供試菌株

根瘤菌株的代謝功能特性因地理環(huán)境與種類不同而有所差異[19]，又因回接篩選實驗工作量較大，故供試菌株選擇了不同地域、不同種類的具代表性的葛藤根瘤菌。

1.4.2盆栽回接方法

種子消毒：百脈根種子依次用酒精(75%)、次氯酸鈉(3%)浸泡2 min、10 min。

菌液培養(yǎng)：供試菌株活化培養(yǎng)后，接種于YMA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min，培養(yǎng)5～7 d。

盆栽播種：在盛有滅菌珍珠石的花缽內(nèi)播下種子，室溫25 ℃、光照16 h/d培養(yǎng)。種子發(fā)芽長出幼苗后澆入Hoagland全營養(yǎng)液(上海國藥)，3周后每盆保留10株幼苗用于菌液回接處理。

回接處理：以只澆灌無菌YMA液體培養(yǎng)基的花盆為空白對照(ck)，每3盆菌液回接(50 mL/盆)的花盆為1個處理，每個處理設(shè)3個重復(fù)。每隔1 d向花缽基質(zhì)中澆灌少量的Hoagland營養(yǎng)液，僅保持基質(zhì)濕潤即可。菌液回接70 d、盆栽生長100 d后取出盆內(nèi)植株，用于回接效果測定。

1.4.3測定植株結(jié)瘤數(shù)及地上、地下生物量

隨機選取每一處理、每一重復(fù)中的3個百脈根植株，空白對照選取1株，共計10株。

統(tǒng)計并計算總瘤數(shù)及單株瘤數(shù)的平均值；分離地上部分和地下根系，于烘箱中105 ℃殺青30 min，降至65 ℃烘干至恒重，計算單株的地上和地下生物量的平均值。

1.4.4數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù)，LSD法進行多重比較，SPSS軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征

經(jīng)分離純化和革蘭氏染色鑒定，25份根瘤樣品共獲得53個(G-)純化菌株。參照《微生物分類學(xué)》[18]，通過對菌體形態(tài)進行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)符合根瘤菌的基本形態(tài)特征。

2.2 根瘤菌株的種類鑒定

按照1.3.2的方法，53個G-菌株的總DNA均形成23 kb左右的條帶以及擴增約1.5 kb的序列片段。如表2所示，通過菌體形態(tài)特征以及16 S rDNA序列比對，共鑒定出共生根瘤菌39株，根瘤內(nèi)生細菌14株。

表2 葛藤根瘤菌株種類鑒定結(jié)果

2.3 區(qū)系分析結(jié)果

如表3所示，53株野生葛藤根瘤菌分屬于7個屬17個種。7個屬分別為：根瘤菌屬(Rhizobium)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、草螺菌屬(Herbaspirillum)和假單胞菌屬(pseudomonas)。其中慢生根瘤菌屬和假單胞菌屬的分布頻率最高，同時達24.39%，為優(yōu)勢屬；在17個種中，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)兩個種的發(fā)生頻率相對較高，分別達14.63%和12.20%，為優(yōu)勢種。

表3 葛藤根瘤菌株區(qū)系分析結(jié)果

表4展示了5個生態(tài)功能區(qū)葛藤根瘤菌的分類及種屬分布結(jié)果。結(jié)果表明，南部干熱河谷南亞熱帶季雨林生態(tài)區(qū)中鑒定出Rhizobium、Bradyrhizobium、Burkholderia、Sinorhizobium、Agrobacterium和Pseudomonas6屬中的11個種，種類最多；其次是鑒定出Rhizobium、Bradyrhizobium、Agrobacterium和Pseudomonas4屬中10個種的東部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)區(qū)；而中部濕潤亞熱帶喀斯特脆弱生態(tài)區(qū)和北部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)區(qū)都只鑒定出Rhizobium和Herbaspirillum2個屬中的2個種；西部半濕潤亞熱帶針闊混交林、草山喀斯特脆弱環(huán)境生態(tài)區(qū)僅鑒定出Pseudomonas中的1個種。

表4 研究區(qū)野生葛藤根瘤菌種屬分布特征

2.4 共生結(jié)瘤固氮高效根瘤菌株的篩選

2.4.1供試菌株

選用22株來自不同地域和不同種類葛藤根瘤菌用于百脈根幼苗的盆栽回接篩選實驗。分別為：CZPR 19-1、CDPR 21-2、WMPR 27-2、LDPR 38-1、PKPR 45-1、LJPR 58-1、LXPR 59-2、SZPR 64-2、SZPR 66-1、SZPR 66-2、ZFPR 85-1、CLPR 294-1、CLPR 294-2、ZPPR 297-2、ZPPR 297-5、LGPR 299-2、LDPR 303-2、LGPR 306-2、TQPR 308-2、LLPR 327-1、DXPR 447-4、DMPR 453-1。

2.4.2葛藤根瘤菌株對百脈根共生結(jié)瘤及促生效果的影響

菌液回接70 d后，百脈根植株的相關(guān)指標測定結(jié)果見表5。結(jié)果表明，與ck相比，22個菌株回接后對幼苗共生結(jié)瘤和生長均有不同程度的促進作用。單株平均根瘤數(shù)在11～56個之間。結(jié)果顯示，14個菌株(CZPR 19-1；CDPR 21-2；WMPR 27-2；LDPR 38-1；PKPR 45-1；LXPR 59-2；SZPR 64-2；SZPR 66-1；ZFPR 85-1；CLPR 294-2；ZPPR 297-5；LGPR 299-2；LDPR 303-2；DXPR 447-4)的結(jié)瘤促生效果較好，與其余菌株差異顯著，為優(yōu)良固氮菌株。其中分離自荔波縣駕歐鄉(xiāng)的LJPR 58-1的結(jié)瘤數(shù)和促生效應(yīng)與其余13個優(yōu)良菌株差異顯著，與另外8個供試菌株的差異達極顯著水平，為最優(yōu)固氮根瘤菌株。

表5 百脈根盆栽回接篩選試驗測定結(jié)果

3 討 論

當前，葛藤在中國有17個種和2個變種，亦有部分研究學(xué)者認為在國內(nèi)有18個種[20]，除新疆、西藏外，廣泛分布于全國各省區(qū)[21]。貴州葛藤資源(1991—1995年)調(diào)查結(jié)果表明貴州省內(nèi)存在10個種。作為全國葛藤資源集中分布的主要地區(qū)之一[22]，貴州省內(nèi)關(guān)于野生葛藤共生根瘤菌的研究較少。

貴州境內(nèi)葛藤根瘤菌區(qū)系分析發(fā)現(xiàn)，5個不同生態(tài)區(qū)的根瘤菌屬、種數(shù)量各異，但每一個功能區(qū)中都存在根瘤菌屬或假單胞菌屬。已有的研究報道表明，與葛藤識別共生的根瘤菌存在著一定的優(yōu)勢種類，發(fā)現(xiàn)較多的是慢生根瘤菌屬，同時也有根瘤菌屬的報道[23-24]；在不同地區(qū)調(diào)查，葛藤根瘤菌均存在遺傳多樣性，在地理分布上，也均具有明顯的生物學(xué)分布格局[25-27]。

本研究結(jié)果與已報道的研究結(jié)論有相似之處，慢生根瘤菌屬是能與葛藤識別并共生的優(yōu)勢種類，但本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬中的部分種類也是與葛藤共生的優(yōu)勢種類，體現(xiàn)了貴州喀斯特地區(qū)的葛藤屬根瘤菌資源存在著區(qū)域性的豐富性與特異性。進一步說明，與同一種豆科植物共生的根瘤菌資源，在不同的地區(qū)、不同的環(huán)境下均存在不同的優(yōu)勢種類，而根瘤菌在特定的生態(tài)地理環(huán)境下針對生物學(xué)地理分布、共生匹配效率與遺傳多樣性又會有顯著的差異。因此，生態(tài)地理環(huán)境對共生根瘤菌資源的多樣性具有重要的影響[28]。豐富多樣的生態(tài)環(huán)境、不同的地理生態(tài)條件均會致使不同種類的根瘤菌與葛屬植物共生結(jié)瘤，貴州作為喀斯特地區(qū)面積最大、生態(tài)環(huán)境最復(fù)雜的省份，從而導(dǎo)致了貴州喀斯特地區(qū)葛藤根瘤菌區(qū)域性的多樣性，為貴州喀斯特地區(qū)石漠化治理提供葛藤這一豆科植物的優(yōu)異種質(zhì)資源，應(yīng)用于生態(tài)恢復(fù)。

4 結(jié) 論

貴州巖溶山區(qū)廣為分布的野生葛藤，作為一種既有飼用價值又有生態(tài)環(huán)境修復(fù)潛力的多年生豆科藤本植物，具有豐富的共生根瘤菌資源。貴州葛藤根瘤菌主要包括根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、伯克氏菌屬、中華根瘤菌屬、土壤桿菌屬、草螺菌屬和假單胞菌屬7個屬的17個種，其中優(yōu)勢屬為慢生根瘤菌屬和假單胞菌屬，優(yōu)勢種為豆根瘤菌和根癌土壤桿菌。在采樣涉及的5個不同生態(tài)功能區(qū)域中，每一區(qū)域除了都包含有慢生根瘤菌屬或者假單胞菌屬的根瘤菌以外，種屬數(shù)量和區(qū)系分布特征另外還存在著明顯的差異性，證明生態(tài)地理環(huán)境對葛藤根瘤菌的種類分布和多樣性有著直接的影響。

本研究根據(jù)共生結(jié)瘤數(shù)、宿主植物地上部干重和地下部干重的影響效應(yīng)三項指標，篩選獲得了14株共生結(jié)瘤促生效果良好的根瘤菌，其中菌株LJPR 58-1被鑒定為優(yōu)良菌株中的最優(yōu)固氮根瘤菌，具有開發(fā)應(yīng)用潛力。篩選結(jié)果說明，共生結(jié)瘤率極強的貴州野生葛藤蘊藏著豐富的優(yōu)良抗逆根瘤菌資源，篩選出的優(yōu)良菌株與葛藤和百脈根形成的優(yōu)勢固氮共生體系能有效應(yīng)用于貴州巖溶山區(qū)草地生態(tài)畜牧和喀斯特環(huán)境修復(fù)的生產(chǎn)實際。