自交不親和性相關基因在蕓薹屬中的研究

謝立人，陳翠萍 ，李開祥，杜德志

(青海大學農林科學院，青藏高原種質資源研究與利用實驗室，國家油菜改良青海分中心，青海省春油菜遺傳改良重點實驗室，西寧 810016)

自交不親和性是指雌雄蕊發育正常的有花植物，在識別本身的花粉或特定基因型的花粉后不能正常授粉或結實的一種現象。這是植物在長期進化過程中形成的一種避免自交與近親繁殖，有利于異交保持生物遺傳多樣性、環境適應性的保護機制。依據花器官的結構，可以將自交不親和性分成同型性自交不親和與異型性自交不親和，異型性自交不親和的植物可以通過花器官區分其親和性，而同型性自交不親和的植物卻不可以[1]。基于自交不親和性的遺傳機理，該特性又可分為兩種，分別為配子體自交不親和(GSI)和孢子體自交不親和(SSI)，而蕓薹屬植物屬于孢子體不親和，它的自交不親和性是由S位點的復等位基因控制，S位點具有很高的多態性[2]。前人研究表明，大多數植物自交不親和性是由一個S位點復等位基因位點控制，少數植物的自交不親和性是由兩個或多個S位點控制(如屬于配子體自交不親和的禾本科植物S-Z位點)[3]。目前關于旋花科、菊科、十字花科孢子體自交不親和的研究有很多報道[4-5]，本文總結了十字花科蕓薹屬自交不親和性相關基因的研究進展，以期為自交不親和性狀的研究和應用提供參考。

1 蕓薹屬SI相關基因的研究

自交不親和反應的發生是一個復雜且精密的過程，在開花植物中，花粉與柱頭乳突接觸后，在其中間形成“花粉足”，并經歷吸附、水合、萌發、花粉管伸長等過程，任何一個過程不能正常進行都會導致自交不親和。而柱頭又可以被分為干性柱頭與濕性柱頭，十字花科植物的柱頭屬于干性柱頭，干柱頭在接受花粉方面有更嚴格的調節，因為花粉必須克服阻止病原體感染的表面屏障，以便允許親和花粉管穿透，在孢子體自交不親和發生時，大量的胼胝質在花粉管頂端積累，阻止花粉管的伸長導致授粉失敗[6]。當成熟的不親和花粉與柱頭接觸時，SRK與SCR識別產生互作，之后與MLPK、ARC1、Exo70A1、GLO1等基因發生一系列的識別，對花粉的水合萌發進行影響，導致自交不親和的發生。

1.1 雌蕊決定因子SRK的研究

S位點受體激酶SRK(S-locus receptor kinase)作為雌蕊自交不親和的決定因子，它的發現晚于S位點糖蛋白SLG(S-locus glycoprotein)，而在此之前，SLG被認為是雌蕊決定因子。S位點糖蛋白SLG最初被Nishio等[7]在1978年從白菜中分離出來。前人研究發現SLG蛋白被一個疏水性的信號殘基分泌到成熟的柱頭乳突細胞的細胞壁和胞間區，與自交不親和反應發生的時間和部位相吻合，所以其最初被認為是蕓薹屬雌蕊的決定因子[8-10]。然而在一些表現自交不親和的甘藍和白菜中，發現其SLG基因發生了功能突變或丟失[11-12]，在Kusaba等[13]和Goubet等[14]對SI的琴葉擬南芥(A.lyrate)研究中，甚至沒有發現SLG的存在，1990年Walker等[15]在玉米中發現一個受體激酶基因ZMPK1與蕓薹屬中的SLG有很高的相似性，1991年Stein等[16]在甘藍中通過對基因組文庫進行篩選，克隆得到一個在S位點上與SLG連鎖的S位點受體激酶SRK，該基因與S位點連鎖，并且在柱頭中特異表達，Watanabe等[17]研究認為，SLG編碼的蛋白與SRK編碼的S受體結構域具有高度同源性，隨后的研究者在白菜、甘藍與甘藍型油菜中克隆了多個位于S位點的SRK等位基因。SRK編碼的蛋白由S受體區域、跨膜結構域和胞內具有磷酸化蛋白功能的激酶結構域三部分組成[16-19]。Takasaki等[20]的研究通過一系列轉基因等實驗，驗證了SRK是蕓薹屬雌蕊的決定基因，該實驗用SRK28和SLG28基因轉入白菜，發現轉入SRK28基因就可以使自交親和SC的白菜成為自交不親和SI，SLG在自交不親和反應可能只起輔助作用，SRK編碼一個跨越乳突細胞質膜的絲氨酸/蘇氨酸受體激酶，是柱頭自交不親和表現的唯一決定因子。這些研究說明自交不親和反應或許不一定需要SLG的參與，而SRK是雌蕊的決定因子，對花粉識別有重要的作用。

1.2 花粉決定因子SCR的研究

蕓薹屬自交不親和性反應花粉識別因子為SP11(S-locus protein 11)/SCR(S-locus cysteine-rich protein)，SCR編碼產物為富含半胱氨酸蛋白的分泌型小肽，該蛋白在花藥絨氈層細胞中特異表達，SCR基因是自交不親和反應中的特異基因，SP11/SCR是一對等位基因[21]。對花粉被蛋白PCPs的研究促使了花粉決定因子的發現，Stanchev等[22]和Doughty等[23]的研究認為，花粉被蛋白的產物是一個類似蛋白大家庭的成員，可以特異性地結合到SLG上。Stephenson等[24]的研究認為，自交不親和性的雄性決定因子是一種蛋白，可能是PCP-A蛋白家族的成員。1999年Schopfer和Suzuk的實驗都證實了SP11/SCR是花粉決定基因[25-26]。Franklin-Tong等[27]對自交親和的甘藍突變體的實驗中，沒有檢測到SCR的存在。SCR與SRK作為配體與受體在花粉與柱頭間形成的復合物，在自花花粉識別中起重要的作用[28]，相同S單倍型的SRK與SCR互相作用產生復合物是自交不親和反應通路上的第一步。也有研究者認為表觀遺傳效應參與了不同S單倍型的顯隱性關系，DNA甲基化導致SP11等位基因的隱性沉默，使之出現了單等位基因表達的現象[29]。之后的研究人員在擬南芥中的研究認為SRK胞外域有幾個糖基化位點，而SRK的激活并不依賴于這些聚糖，表明SP11/SCR結合是在氨基酸水平上指定的[30]。而蕓薹屬SI反應信號通路是一個復雜的細胞間信號傳導過程，其自交不親和性的作用機制還有待進一步研究。

1.3 SI信號通路中相關基因的研究

除了S位點之外還有許多其他基因參與自交不親和反應，包括MLPK(M位點蛋白激酶)、ARC1(臂展重復蛋白)、THL1/2(類硫氧還蛋白h)、Exo70A1(胞吐復合物)、GLO1(乙二醛酶)等基因。這些基因在SCR與SRK識別后起作用，形成一個信號通路，最終導致自交不親和性。對白菜型油菜Yellow Sarson突變體的研究發現了M位點蛋白激酶(MLPK)，M位點和S位點是互相獨立的，質膜定位表明它可能在SRK附近發揮作用，磷酸化的SRK和MLPK(M位點蛋白激酶)之后再與ARC 1相互作用，MLPK對自交不親和起正調控作用[31-32]。MLPK有兩種不同的轉錄本，MLPKf1和MLPKf2，它們是通過不同的轉錄起始位點產生的，編碼兩種僅在N端不同的亞型，兩者翻譯的蛋白都在乳突細胞膜上，并且MLPK能與SRK直接互作[33]。Chen F等[34]利用RNA沉默與CRISPR/Cas 9技術對甘藍型油菜MLPK基因進行研究，自交不親和反應在RNA沉默后部分被抑制，在自交不親和系“S-70”中敲除MLPK后的SI油菜完全變為自交親和植株。這些研究表明，MLPK是SI信號通路上與SRK相互作用的重要因子。前人通過篩選與S-位點受體激酶(SRK)結構域相互作用的酵母雙雜交蛋白庫，分離出一種名為ARC 1的蛋白，RNA印跡分析顯示，ARC1的表達局限于自交不親和反應的柱頭部位，是油菜柱頭特異表達的基因[35]。研究者認為ARC1是SRK的下游效應物，實驗證實上調ARC1基因表達可以使自交不親和植株的結籽減少，下調ARC1基因表達的植株發生自交部分結籽，因此與MLPK相似的是ARC1也屬于自交不親和反應的正調控基因[36]。之后的研究表明ARC1擁有一個U-box結構，具有E3泛素連接酶活性，泛素化蛋白水平在不親和授粉時提高，而ARC1促進雌蕊親和性因子的泛素化，降解親和反應的蛋白，進而導致自交不親和的發生[37]。另外，前人對自交不親和琴葉擬南芥(Arabidopsis lyrata)的轉基因實驗證明ARC1可能是自交不親和反應所必須的基因[38-39]。類硫氧還蛋白(THL 1/2)是Bower等通過酵母雙雜的方法篩選到的，當柱頭未授粉時，SRK被類硫氧還蛋白抑制，SRK的磷酸化受到阻礙,所以類硫氧還蛋白可能是SRK磷酸化的抑制劑,是自交不親和的負調控因子[40-41]。前人在篩選與ARC1相互作用的蛋白時，發現了甘藍型油菜Exo70A1基因，當在自交不親和油菜“W 1”的柱頭中Exo70A1過表達可以部分克服自交不親和，抑制Exo70A1表達時表現出柱頭上花粉無法萌發[42]，在植物中，ARC1抑制Exo70A1，來阻斷基底花粉識別途徑，從而阻止乳頭質膜上的囊泡/MVB分泌，發生SI反應[43]。因此Exo70A1也可能是自交親和反應的重要因子。Sankaranarayanan等[44]的研究表明，GLO 1是授粉所需的柱頭親和因子，自交不親和的甘藍型油菜柱頭過表達GLO1會導致自交不親和反應的部分破壞，導致不親和授粉部分結籽。自花授粉后，ARC 1介導GLO 1泛素化降解含量降低，導致丙酮醛(MG)水平的增加，MG具有細胞毒素，破壞柱頭乳突細胞導致自交不親和的發生。因此GLO1基因是自交親和的重要因子。根據前人的研究狀況，我們可以發現自交不親和反應信號通路是一個復雜的過程。當柱頭未授粉時，SRK被類硫氧還蛋白抑制，而自花授粉時(圖1)，S單倍型相同或屬于種間同源對的花粉配體(SCR)與柱頭中的受體(SRK)相互作用并通過自體磷酸化作用激活SRK，磷酸化的SRK與質膜定位的MLPK相互作用，共同磷酸化激活E 3泛素連接酶ARC 1，因此MLPK和ARC 1起著正調控的作用，而GLO 1與Exo 70 A 1起負調控的作用，激活的ARC 1泛素化降解親和反應關鍵蛋白GLO 1和Exo 70 A 1，導致MG的增加，細胞內引起自噬的激活，從而影響花粉的正常水合萌發，最終引起自交不親和反應。

圖1 孢子體自交不親和反應通路

柱頭未授粉時，SRK被THL1/2抑制，而識別到自花花粉時，SCR與SRK相互作用并通過自體磷酸化作用激活SRK，之后磷酸化的SRK與MLPK相互作用，共同磷酸化激活E 3泛素連接酶ARC 1，激活的ARC 1泛素化降解親和反應關鍵蛋白GLO 1和Exo 70 A 1，導致MG的增加，引起自噬的激活，從而影響花粉的正常水合萌發。

2 蕓薹屬S單倍型的研究

隨著SLG、SRK、SP11/SCR基因被克隆與序列的比對，研究者發現不同的SP11/SCR和SRK等位基因共同進化成一系列S單倍型，編碼相應的配體-受體對，這些組合以一個整體向子代傳遞，幾乎不發生重組，這些組合被分為不同的S單倍型[45]。當兩種相同S單倍型花粉與柱頭結合時發生不親和反應，不同S單倍型自交不親和花粉與柱頭組合時，則能發生異交[46]。也有例外，在甘藍與白菜的研究中也發現，一些相同的S單倍型之間可以互相識別(如BrS-60與BoS-15)，這些S單倍型被稱作種間同源對[47]。根據SLG與SRK序列的相似性，S單倍型被分為Ⅰ類和Ⅱ類，遺傳分析表明，Ⅰ類S單倍型相對于Ⅱ類S單倍型屬于顯性，并且Ⅰ類S單倍型的自交不親和性更強[48]。對白菜不同單倍型研究表明，這種S單倍型的顯隱性關系在柱頭與花粉之間是互相獨立的，花粉端(SCR)之間一般表現出顯隱性，而柱頭中(SRK)之間通常是共顯性的[49]。Kakizaki等[50]選取4個白菜型油菜Ⅱ類S單倍型的(6種組合)雜合型與其親本純合型進行授粉實驗，在其花粉側發現線性顯隱性關系，確定Ⅱ類S單倍型的顯隱性關系為BrS44>BrS60>BrS40>BrS29。Shiba等[51]通過對白菜Ⅰ類S單倍型(S52)與Ⅱ類S單倍型(S60)進行研究，發現在S52與S60的雜合材料中，來自S60的SCR基因表達量明顯降低，Fujimoto[52]的研究表明，在Ⅰ類/Ⅱ類雜合株中，Ⅰ類與SCR基因無功能時，Ⅱ類SCR也不表達，所以SCR的顯隱性關系是轉錄水平調控的。sRNA和miRNA廣泛參與細胞內基因表達調控，在白菜Ⅰ類單倍型SLG上游5 kb左右發現存在一段與SCR啟動子區被甲基化的序列高度同源的序列，命名為SP 11-methylation-inducer region(SMI)，這段序列可以產生一個24-nt的小RNA，Tarutani等[53]原位雜交實驗表明，隱性SP11等位基因的啟動子區域在花藥絨氈層中特異性甲基化，SMI誘導Ⅱ類SCR啟動子區域發生高度的DNA甲基化，這種甲基化使Ⅱ類SCR基因沉默，SMI的發現很好地解釋了Ⅰ類、Ⅱ類S單倍型間顯隱性的分子機理。最近Yasuda等[54]的研究發現，在Ⅱ類S單倍型SRK基因下游(5～10 kb)存在另一個產生小RNA的位點SMI2，對4個線性顯隱性關系做出解釋，在轉基因實驗中研究者將白菜BrS60單倍型的SMI 2分別轉入BrS40、BrS29和BrS44純合單倍型植株中，BrS40和BrS29轉基因材料表現自交親和表型，SCR基因均沒有表達，而在BrS44轉基因植株仍表現自交不親和的表型，說明BrS60單倍型的SMI 2可以抑制隱性單倍型BrS40和BrS29的SCR基因的表達。這個模型的提出為自交不親和反映顯隱性研究提供了重要的基礎。

3 展 望

自交不親和性作為保持生物遺傳多樣性、環境適應性的重要機制引起了許多學者的關注與研究，對蕓薹屬孢子體自交不親和的廣泛研究已經在較大程度上揭示了導致自交不親和發生的信號通路(如圖1)。在SI反應信號通路中，除了S位點的基因，還有一些非S位點的因子與S位點基因互作，具有極其復雜的機制，挖掘其他參與SC與SI重要因子與它們的功能分析是值得深入探究的問題。研究者在擬南芥中發現表觀遺傳效應在自交不親和反應中具有重要作用，目前DNA甲基化相關的基因是否參與蕓薹屬植物自交不親和反應還未見報道，進一步對DNA甲基化在蕓薹屬SI中的作用研究具有重要的意義。在生產應用方面，可以利用雜種優勢中的自交不親和途徑選育優良的農作物品種，而自交不親和性的分子機制研究為分子育種工作提供極其重要的理論支撐。