微生物發(fā)酵對雜糧代餐粉品質特性及抗氧化活性的影響

陳 悅，陳 嵐，高 路

(沈陽師范大學糧食學院，沈陽 110034)

代餐粉是一種單一或綜合性沖調粉劑產品，主要以谷類、豆類、薯類為原料，方便即時、易于攜帶[1]。谷物富含蛋白質且氨基酸分布均衡，含有大量的膳食纖維、鐵、鋅、維生素等營養(yǎng)成分[2]。雜糧富含的膳食纖維可增加人體飽腹感，延緩食物消化速度；雜糧中的植物固醇在一定程度上也可降低膽固醇的含量，對調節(jié)血糖血壓、降低人體慢性病的發(fā)病率起著重要作用[3]。但雜糧中的膳食纖維使產品適口性變差、沖調性下降，因此雜糧在投入工業(yè)生產時利用率降低。

微生物在發(fā)酵過程中產生多種水解酶，可以將大分子化合物分解成人體更易吸收的小分子物質，增加生物利用率[4]。微生物發(fā)酵可以顯著提升產品的感官品質，發(fā)酵產生的有機酸、多肽、甘氨酸、游離脂肪酸等對產品的口感和香氣起著重要作用[5]。植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌間具有協(xié)同作用，植物乳桿菌降解雜糧中大分子物質，產生大量乳酸，酸性環(huán)境可維持嗜酸乳桿菌正常的細胞壁和細胞膜結構，而植物乳桿菌在發(fā)酵過程中合成的葉酸又可供給嗜酸乳桿菌生長[6]。徐安書等[7]選用植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌開發(fā)出具有保健功能的莖瘤芥保健飲料產品，提高莖瘤芥的附加值。趙麗娜等[8]用嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌混合發(fā)酵，旨在為開發(fā)一種富含益生菌和β-葡聚糖的功能性產品提供基礎。

本研究以10種雜糧為原料制備雜糧代餐粉，采用復合菌種對原料進行發(fā)酵處理，探究發(fā)酵對雜糧代餐粉品質特性、抗氧化活性的影響。以期為確定雜糧代餐粉的發(fā)酵工藝參數(shù)提供有益參考，也為探究微生物發(fā)酵對雜糧代餐粉品質特性和抗氧化活性的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫羅蘭紫薯、東北黃豆、紅皮花生仁、黑芝麻籽、玉米(丹玉69號)、黃小米、長粒香糙米、白色藜麥、純種小薏苡仁、青稞(肚里黃)。

植物乳桿菌JYLP-002、嗜酸乳桿菌JYLA-191；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、過硫酸鉀均為分析純。

1.2 儀器與設備

JTM60膠體磨，Scientz-150高壓均質機，SD-1500噴霧干燥機，CHROMA METER CR-400型色差儀，Q20-差式掃描量熱儀。

1.3 方法

1.3.1 雜糧代餐粉的工藝流程

原料→膠體磨→50目過濾→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵→高壓均質→噴霧干燥→雜糧代餐粉

1.3.2 雜糧代餐粉的操作要點

取新鮮紫薯清洗、去皮、護色[9]，其余原料除雜、清洗、浸泡，將10種原料(紫薯108.00 g、黃豆58.00 g、花生仁57.00 g、芝麻籽9.78 g、玉米8.00 g、小米7.70 g、糙米5.47 g、藜麥4.50 g、薏米4.00 g、青稞3.00 g)加水(料液比為1∶6)后用膠體磨打漿并過濾[10]，再用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，備用。把經過發(fā)酵的混合漿液進行高壓均質(P=40 MPa，t=2～5 min)、噴霧干燥處理(噴霧壓力0.20 MPa、進料流量400 mL/h、進風溫度160 ℃、熱風流量45 m3/h)，最后制得雜糧代餐粉。

1.3.3 菌種活化

將2個菌種的凍干粉溶于無菌水混勻，在MRS固體培養(yǎng)基中進行涂布，37 ℃培養(yǎng)24 h。取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中活化2次，以2%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h至菌體濃度為108CFU/mL。

1.3.4 單因素實驗

分別固定接種比例為1∶1、發(fā)酵時間為11 h、發(fā)酵溫度為34 ℃、接種量(菌質量分數(shù))為3%，考察各因素對可溶性固形物的影響。將復合菌接種比例設定為0∶1、1∶2、1∶1、2∶1、1∶0，發(fā)酵時間設定為5、7、9、11、13 h，發(fā)酵溫度設定為28、31、34、37、40 ℃，接種量設定為1%、3%、5%、7%、9%，不進行發(fā)酵處理的樣品作為對照組。

1.3.5 正交實驗優(yōu)化

根據單因素實驗結果，進行4因素3水平正交實驗，確定雜糧代餐粉的最佳發(fā)酵條件，因素與水平如表1所示。

表1 正交實驗因素與水平

1.3.6 可溶性固形物測定

取待測樣品于70 ℃烘箱烘干至恒重，準確稱取干燥后樣品0.1 g并加入0.9 mL蒸餾水，配制成10%溶液，于100 ℃水浴30 min，再以3 000 r/min離心30 min[11]。

式中：A為樣品中可溶性固形物質量分數(shù)/%；A0為溶液中可溶性固形物質量分數(shù)/%。

1.3.7 沖調性測定

以分散性和潤濕性為考察指標測定沖調性[12]。

其中分散性的測定：稱取1.0 g樣品，并加入25 mL去離子水進行磁力攪拌(轉速300 r/min)，記錄樣品全部分散于水中所用時間。

潤濕性的測定：稱取1.0 g樣品，置于50 mL 50 ℃的去離子水中，記錄樣品在水中全部潤濕所用時間。

1.3.8 色澤測定

以CIEL ab表色系統(tǒng)測定樣品的L*(明-亮)、a*(紅-綠)和b*(黃-藍)值，根據所得數(shù)據，計算色度(C*)，色相角(H*)，總顏色(E*)，色差(ΔE*)和白度(W)。

C*=(a*2+b*2)0.5

E*=(L*2+a*2+b*2)0.5

W={100-[(100-L*)2+(a*2+b*2)]0.5}×100%

1.3.9 水合特性測定

稱取0.5 g樣品于20 mL蒸餾水并混合均勻，在25 ℃和100 ℃水浴30 min，然后高速離心30 min(轉速10 000 r/min)[13]，倒出上清液烘干至恒重。

式中：m為樣品質量/g；m1為離心管中沉淀的質量/g；m2為干燥至恒重的上清液質量/g。

1.3.10 持水力測定

準確稱取0.25 g樣品與25 mL去離子水于50 mL離心管中，搖勻后在室溫下靜置60 min，然后離心15 min(轉速3 000 r/min)[14]。

式中：m0為樣品質量/g；m1為離心管質量/g；m2為吸水后樣品和離心管質量/g。

1.3.11 持油力測定

將0.5 g樣品與4.0 g大豆油混合均勻，在37 ℃的水浴鍋中靜置4 h，離心15 min(轉速4 000 r/min)[15]。

式中：m0為樣品質量/g；m1為離心管中沉淀質量/g。

1.3.12 粉體特性測定

1.3.12.1 休止角及滑角的測定[16]

休止角(θ)：將漏斗底端固定在距離桌面(H)3 cm的鐵架臺上，在漏斗下端放置一張方格紙，再將樣品勻速倒入漏斗，直至形成的錐體頂端接觸到漏斗底部，測量錐體直徑記作2R。

滑角(α)：稱取5.0 g樣品置于長(L)130 mm的玻璃板上，將平板一端緩緩抬起，記錄樣品開始下滑時平板的垂直高度(H)。

1.3.12.2 松密度(ρB)、輕敲密度(ρT)、卡氏指數(shù)(Carr)、霍斯納比值(Hausner)的測定

ρB：取一個50 mL量筒，將樣品緩緩倒入量筒中至20 mL標記處，準確稱量樣品倒入后量筒的質量。

式中：m1為量筒的質量/g；m2為樣品與量筒的總質量/g；VB為注入樣品的體積/mL。

ρT：然后用手輕敲量筒300次，記錄敲擊后樣品體積。

式中：VT為敲擊后樣品的體積/mL。

Carr指數(shù)、Hausner比值按公式計算。

1.3.12.3 川北方程[17]

取樣品緩慢倒入量筒至100 mL處，然后將量筒從垂直桌面1 cm高度處自由落下，直至體積不變，記錄此時樣品體積和落下次數(shù)。川北方程變形為：

式中：n為輕敲次數(shù)(即落下次數(shù))；a為輕敲次數(shù)無窮大時體積減少數(shù)；b為充填速度常數(shù)；C為樣品相對體積減小數(shù)。

輕敲次數(shù)無窮大時：

式中：V0為初始體積；Vn為輕敲n次后樣品體積；V∞為輕敲無窮次后樣品體積。

1.3.13 DSC糊化特性測定

稱取樣品5 mg于DSC鋁盒中，溫度范圍20～200 ℃，升溫速度為10 ℃/min，以密封空鋁盒作為對照進行掃描。

1.3.14 抗氧化活性測定

提取液的制備[18]：準確稱取1 g樣品，用50 mL(每次25 mL)80%乙醇溶液作提取液，再用均質機5 000 r/min間歇破碎5 min，超聲提取20 min，5 000 r/min離心15 min后取上清液，提取2次，合并、定容，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.14.1 DPPH·清除率測定

將0.1 mL樣品提取液與2 mL 0.2 mmol/L DPPH、2.9 mL無水乙醇混合并搖勻，然后放置暗處靜置30 min，在517 nm處測吸光值[19]。

式中：Ac為用無水乙醇代替樣品液時的吸光度；Aj為加樣品，用無水乙醇代替DPPH時的吸光度；Ai為加樣品與DPPH時的吸光度。

1.3.14.2 ABTS+·清除率測定

將ABTS溶液(7 mmol/L)與過硫酸鉀溶液(2.45 mmol/L)以1∶1混合均勻，于室溫下避光14～16 h，記作ABTS母液。用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(濃度0.20 mol/L)將ABTS母液稀釋至734 nm波長處的吸光值為0.72～1.20[20]。

取1 mL樣品提取液與4 mL稀釋后的ABTS溶液反應6 min，在734 nm處測吸光值。

式中：AC2、AS2分別為空白組和不同樣品組的吸光值。

1.3.14.3 還原能力測定

將2.5 mL 0.2 mol/L PBS溶液 和2.5 mL 2%的鐵氰化鉀溶液加入到0.1 mL提取液中，50 ℃水浴20 min，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，搖勻，5 000 r/min離心10 min。吸取2.5 mL上清液并依次加入0.5 mL 0.1%三氯化鐵和2.5 mL蒸餾水，靜置10 min，于700 nm波長處測吸光值[21]。

1.4 數(shù)據處理

每組實驗重復3次，實驗數(shù)據以平均值±標準差表示，采用Origin pro 2018作圖，使用SPSS 26.0中單因素ANOVA檢驗進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

可溶性固形物以可溶性糖類為主，還包括有機酸、維生素、礦物質等營養(yǎng)物質[22]。可溶性固形物與發(fā)酵進行程度、發(fā)酵產生的可溶性糖和有機酸等營養(yǎng)物質呈正相關。圖1為接種比例、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量對雜糧代餐粉可溶性固形物的影響。

圖1 接種比例、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量對雜糧代餐粉的可溶性固形物影響

植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌的比例為1∶2時，可溶性固形物達到最大值。2個菌種的接種比例從0∶1到1∶0，可溶性固形物先上升后下降，因為植物乳桿菌添加量的增加促進了兩菌種間的協(xié)同作用，可溶性固形物上升，而過多的植物乳桿菌又會與嗜酸乳桿菌產生拮抗作用，形成競爭關系，從而抑制發(fā)酵的進行，可溶性固形物減少。

隨著發(fā)酵時間的增加，可溶性固形物先增大后減少。可能因為隨著底物中碳源和氮源的減少，菌種正常代謝受阻，導致植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌生長緩慢，菌種活性的減弱進而導致可溶性固形物溶出速度減慢，最后達到飽和，即7 h處。7 h后隨著乙醇等微生物發(fā)酵產物的積累，致使可溶性固形物所占比例減少。

發(fā)酵溫度在28～37 ℃之間時，可溶性固形物直線上升，37 ℃后呈下降趨勢。可能因為適宜的溫度提高兩個菌種的繁殖速率，菌種良好的代謝可以更好地降解植物細胞壁并釋放可溶性固形物[23]。當發(fā)酵溫度低于37 ℃菌種代謝活動緩慢，可溶性固形物較小，高于37 ℃代謝活動又受到抑制，只有發(fā)酵溫度在37 ℃時，菌種才能達到最適生長溫度，此時可溶性固形物越大含量最高。

隨接種量增加，可溶性固形物呈先上升后下降趨勢。這可能是由于微生物生長受碳源和氮源影響，菌種只有在底物充足的條件下才能穩(wěn)定生長[24]。在接種量為7%時可溶性固形物達到最大值，說明此時活菌數(shù)較多，乳桿菌對底物反應充分。接種量繼續(xù)增加，菌種間產生競爭作用使生長繁殖受到抑制，導致菌種對底物反應不充分，可溶性固形物含量降低。

2.2 正交實驗結果

根據預實驗和單因素實驗結果，以可溶性固形物和沖調性為指標，利用L9(34)正交實驗進行工藝優(yōu)化。利用加權系數(shù)法賦予各指標權重分別為可溶性固形物占40%，沖調性占60%。按公式計算[25]：

綜合分=A1×40%+A2×30%+A3×30%

式中：A1為可溶性固形物隸屬度；A2為分散時間隸屬度；A3為潤濕時間隸屬度。

如表2可知，各因素對雜糧代餐粉的綜合分影響主次順序為D>B>C>A。取得綜合分最大時的組合A3B2C1D3為最優(yōu)組合。

表2 正交實驗設計與結果

由表3可知，接種量對雜糧代餐粉的綜合分影響顯著(P<0.05)，發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和接種比例影響不顯著且對綜合分的影響程度依次遞減。

表3 方差分析

2.3 色澤測定結果

色澤是反映產品品質的重要指標之一，其中色度C*表示顏色的色調和飽和度，色度值升高，顏色越深。如表4所示，樣品組色度小于對照組，說明樣品組顏色更淺。兩樣品色相角H*相差不大，樣品組的總顏色E*比對照組增加了29.28%。色差ΔE是用數(shù)值方式表示兩顏色之間色彩的差別，發(fā)酵使ΔE減小，說明樣品組與標準白板相比色澤變化更小，顏色更亮。白度W可以量化色澤的變化，樣品組與對照組相比增加了33.18%，可能由于菌種生長繁殖等原因導致產品白度發(fā)生改變[26]。

表4 發(fā)酵對雜糧代餐粉色澤的影響

2.4 水合特性測定結果

吸水指數(shù)反映了粉體的糊化程度。由表5可知，經過發(fā)酵處理的雜糧代餐粉吸水指數(shù)下降。與對照組相比，樣品組的水溶性顯著增加，25 ℃和100 ℃分別增加了1.38、1.42倍。這可能是因為樣品經發(fā)酵處理后淀粉等大分子化合物被分解成小分子物質，比表面積增大，易于水溶性物質溶出。另外，發(fā)酵處理可能會使部分不溶于水成分的價鍵發(fā)生斷裂，從而轉化為可溶性物質。膨脹勢反映了淀粉懸浮液在糊化過程中的吸水性和離心后的持水能力[27]。對照組相比，樣品組膨脹能力顯著提高。

表5 發(fā)酵對雜糧代餐粉水合特性的影響

2.5 持水力、持油力測定結果

由圖2可知，樣品組的持水力與對照組相比顯著增強，持油力減弱。這是由于發(fā)酵處理使雜糧代餐粉的內部結構發(fā)生部分降解而變得疏松，表面羧基、羥基等親水基團暴露[28]，從而使持水力變大；而油脂與其接觸面積減小，導致持油力變小。

圖2 發(fā)酵對雜糧代餐粉持水力和持油力的影響

2.6 粉體特性測定結果

松密度和輕敲密度主要與顆粒大小、形狀，以及顆粒間的黏附趨勢和孔隙率有關[29]，密度越大，填充性越好。如表6可知，雜糧代餐粉經發(fā)酵處理后松密度與輕敲密度均增加。休止角和滑角反映了粉體的流動性，角度越小，流動性越好，流動性好的產品可以增加其穩(wěn)定性、混合后不易分層[30]。樣品組的休止角和滑角均比對照組小，說明樣品組的流動性更好。經過發(fā)酵處理的雜糧代餐粉Carr指數(shù)和Hausner比值分別減小了32.75%、9.77%。說明發(fā)酵可以提高粉體的流動性，對產品在生產和運輸中具有重要意義。

表6 發(fā)酵對雜糧代餐粉粉體特性的影響

一般認為，a值越小，粉體的流動性越好；1/b值越小，粉體的填充速度越大，填充更易于進行。由表7可知，樣品組a值和1/b均小于對照組。這表明樣品組的流動性和填充性均較對照組有所提升。

表7 川北方程擬合參數(shù)結果

2.7 DSC測定結果

由表8可知，樣品組的糊化起始溫度T0低于對照組，這說明經過發(fā)酵處理的雜糧代餐粉更易于糊化。與對照組相比，樣品組熱焓值ΔH增加，可能因為發(fā)酵使直鏈淀粉含量增加，其溶出利于脂類與其結合形成復雜的雙螺旋結構，進而增加了糊化過程中所需的熱量。

表8 雜糧代餐粉的DSC變化的熱分析數(shù)據

2.8 抗氧化活性測定結果

由表9可知，與對照組相比，樣品組的DPPH·清除率和ABTS+·清除率均提高。此外，發(fā)酵對產品的還原能力也有所提升。研究表明，發(fā)酵產品具有較強的抗氧化活性，主要原因為：一是菌種產生的酶與不同基質發(fā)生反應而具有抗氧化性，二是發(fā)酵使氨基酸轉氨生成α-酮酸，進一步降解產生醛類、羧酸等抗氧化活性物質[31]。

表9 雜糧代餐粉的抗氧化性測定結果

3 結論

本研究以雜糧為原料，利用正交實驗對雜糧代餐粉發(fā)酵條件進行優(yōu)化，探究了發(fā)酵對產品的品質特性、抗氧化活性的影響。結果表明，雜糧代餐粉最佳發(fā)酵條件為：接種比例1∶1，發(fā)酵時間7 h，發(fā)酵溫度34 ℃，接種量9%。通過對雜糧代餐粉品質特性的進一步研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵對雜糧代餐粉色澤影響顯著；經發(fā)酵處理的雜糧代餐粉吸水指數(shù)減小，水溶性、膨脹勢、持水力增強，持油力減弱；粉體流動性和填充性均得到改善；更加易于糊化；DPPH·清除率、ABTS+·清除率、還原能力提高。