游泳訓練對腦出血大鼠認知功能及NMDAR表達的影響

徐澤紅 孫林林 郭付有

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)作為一種常見的腦血管疾病，其病死率和致殘率極高，50%的幸存者有認知功能障礙，對此目前尚缺乏有效的治療方法[1-3]。游泳可改善腦缺血后的認知功能障礙[4]，但其對ICH導致的認知功能障礙是否有效，目前尚未明確。研究[5-6]發現，ICH后神經細胞壞死，突觸可塑性破壞，炎癥因子大量釋放，谷氨酸大量釋放，與 N-甲基-d-天冬氨酸受體(N-methyl-d-aspartate receptor, NMDAR)過度激活有關。NMDAR包括NR1和NR2B亞基，是記憶形成的基礎，與神經突觸的功能和行為認知有密切關系[7]。文獻[8]報道,可通過降低NR1和NR2B亞基的表達改善卒中大鼠的神經功能。目前游泳訓練改善認知功能的機制尚不明確，本研究建立ICH大鼠模型，觀察游泳訓練是否可改善ICH大鼠的認知障礙并以NMDAR為靶點進一步探討其調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 成年雄性Sprague-Dawley大鼠30只，由鄭州市第七人民醫院動物實驗中心提供，體質量(300±50)g，8周齡。每籠5只大鼠，飼養溫度22～24℃，光/暗循環保持12/12 h交替，自由進食、水，喂養1周。實驗前，所有大鼠進行適應性游泳訓練，共3 d(第1天訓練10 min，第2天20 min，第3天30 min)。第4天，將大鼠根據隨機數字表法分為3組，即假手術組、模型組、游泳組，每組各10只。本實驗研究方案已得到鄭州市第七人民醫院倫理委員會批準。

1.2 試劑及儀器 試劑：蛋白質濃度測定試劑盒(Bioswamp，湖北)，一抗NMDAR (CST，美國)，熒光二抗(Santa Cruz，美國)，一抗NR1(Abcam，美國)，NR2B(Abcam，美國)。儀器：正置熒光顯微鏡(Olympus，日本)，Morris水迷宮(淮北正華，安徽)。

1.3 動物模型制作方法 模型組和游泳組參考Zhang等[9]文獻所述方法制作動物模型，大鼠術前禁食水6 h后， 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量350 mg/kg。將其以俯臥位固定于腦立體定位儀上。顱頂做切口，暴露冠狀縫，定位右側尾狀核區 (冠狀縫前0.2 mm，中線偏右側3 mm)，顱骨鉆孔達硬腦膜。使用5 μL的微量注射器，沿孔垂直刺入腦內，深度達6 mm，將2 μL I型膠原酶及1 μL肝素鈉溶液以0.3 μL/min的速度緩慢注入尾狀核內，總注射時間為10 min。注射后，停留10 min，然后緩慢將針拔出。拔針后，用醫用骨蠟密封鉆孔，縫合切口。假手術組同模型組做切口，顱骨鉆孔達硬腦膜，插入微量注射器針頭至右側尾狀核，停留10 min，緩慢拔針，骨蠟封閉，縫合切口。

術后2 h待大鼠清醒后采用改良的神經功能缺損評分法(modifiedneurological severity score, mNSS)[10]，評分7～12分的大鼠視為模型建立成功。

1.4 游泳訓練 模型制作成功后1周，游泳組大鼠進行游泳訓練。將大鼠放入游泳池 (直徑：0.6 m，高度：1 m)，水溫保持在29～31℃，水面距桶邊緣0.4 m，每天游泳60 min，連續訓練5 d。另外兩組不進行游泳訓練。

1.5 神經功能評分 造模成功后及經1 d、3 d、5 d游泳訓練后進行神經功能缺損評分。采用mNSS量表[10]對各組大鼠進行神經功能評定。包括提尾反射、反常運動、平衡木實驗、行走測試、反射缺失和感覺測試等。評判標準：輕型受損1～6分，中型受損7～12分，重型受損13～18分。

1.6 水迷宮檢測 造模成功后2周，用水迷宮(morris water maze test, MWM)法評價3組大鼠術后認知功能。實驗前，所有大鼠都在MWM里自由游泳15 min。在定位導航任務中，將大鼠面向池壁隨機放置在同一象限上，本實驗持續4 d，每天記錄大鼠在120 s 內找到平臺的時間，即為逃避潛伏期。取下平臺，把大鼠放進水池，每天記錄120 s 內目標象限的時間百分比。

1.7 免疫熒光 完成MWM檢測后，處死大鼠，取腦組織，常規石蠟包埋，取厚度5 μm切片，在0.01 M PBS 中清洗切片3次，每次5 min，共15 min，滴加蛋白酶K進行消化處理， 37℃條件下孵育5 min。抗原封閉處理采用山羊血清，先滴加一抗 N-甲基-d-天冬氨酸受體(NMDAR, 1∶100，美國CST)，在4℃條件下孵育過夜；再滴加二抗(FITC，1∶50，Santa Cruz)，在室溫下孵育90 min。用PBS清洗玻片2次，每次5 min。4’，6’-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI, 1∶200，Santa Cruz)對細胞核進行染色，滴加甘油封片。熒光顯微鏡(Olympus, TXM-500C)下觀察，400倍鏡下隨機選取3個視野進行拍照，觀察免疫陽性強弱。

1.8 蛋白印跡 完成MWM檢測后，深度麻醉大鼠，迅速斷頭，冰上取腦，快速分離對側海馬CA3區，置于預冷EP管中，隨后保存在-80℃的冰箱中，手術需在2 min內完成。將組織切成小塊，加入裂解液，其中混有蛋白酶和磷酸酶抑制劑。放入4℃離心機1 000 r/min 離心15 min，取其上清液，進行蛋白定量，保存在-80℃冰箱。等效樣品(10 μg)高壓鍋煮沸變性，采用SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳，90 V濕式轉膜50 min。采用5%脫脂奶粉封閉抗原2 h，一抗NR1、NR2B 在4℃條件孵育過夜，PBS洗膜5 min，重復洗3次。1∶1 000的辣根過氧化物酶標記的二抗，在室溫下孵育1 h。用PBS洗滌3次，每次5 min。按說明書1∶1均勻混合ECL化學發光試劑A和B，全自動化學發光顯影。分析條帶的灰度值利用Image J軟件進行。

2 結果

2.1 3組大鼠不同游泳時間mNSS評分比較 重復測量方差分析結果顯示，組別和時間交互作用差異無統計學意義(P>0.05)；組間差異有統計學意義，即與模型組相比，游泳組的mNSS評分更低，差異有統計學意義(P<0.05)；mNSS評分隨時間降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠mNSS評分的比較分)

2.2 3組大鼠不同時間認知功能的比較 3組大鼠逃避潛伏期隨著時間變化而縮短，差異有統計學意義(P<0.05)；與假手術組相比較，模型組各時間點逃避潛伏期均延長，差異有統計學意義(P<0.05)，與模型組相比較，游泳組在第2、3、4天逃避潛伏期均縮短，差異具有統計學意義(P<0.05)，組別和時間交互作用下無統計學意義(P>0.05)。 3組大鼠目標象限時間占比隨著時間變化而增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與假手術組相比較，模型組各時間點目標象限時間占比均減小，差異有統計學意義(P<0.05)，與模型組相比較，游泳組在第2、3、4天目標象限時間占比均增加，差異具有統計學意義(P<0.05)，組別和時間交互作用無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠逃避潛伏期和目標象限時間占比的比較

2.3 3組大鼠NMDAR免疫熒光結果比較 取各組大鼠腦組織，冠狀位切片，進行NMDAR免疫熒光染色，置于免疫熒光顯微鏡下觀察CA3區。假手術組的樣本可見少量NMDAR免疫陽性的神經細胞被綠色熒光標記，陽性細胞占比為(22.5±0.03)%；模型組NMDAR免疫陽性神經細胞數為(60.6±0.05)%，游泳組 NMDAR 免疫陽性神經細胞數為(43.5±0.04)%，差異有統計學意義(F=1.309，P<0.001)。見圖1。

假手術組 模型組 游泳組

2.4 NR1和NR2B Western blot檢測結果比較 采用Western blot檢測各組大鼠海馬CA3區NR1和NR2B蛋白的表達水平。與假手術組相比，模型組大鼠海馬CA3區NR1和NR2B表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05 )；與模型組相比，游泳組海馬CA3區NR1和NR2B的表達減少，差異有統計學意義(P<0.05 )。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠海馬CA3區NR1和NR2B Western blot結果

表3 各組大鼠海馬CA3區NR1和NR2B蛋白表達量的比較

3 討論

研究[11]報道，游泳可改善出血性卒中大鼠的認知功能，其機制可能是通過促進大鼠海馬區神經營養因子的釋放，減少突觸損傷，促進突觸生長改善認知障礙。本實驗結果發現，與模型組相比較，游泳組的逃避潛伏期明顯縮短，目標象限時間明顯延長，表明游泳可能改善了腦出血大鼠的認知功能。

NMDAR是一谷氨酸受體[12]，在靜止狀態下，NMDAR的離子通道被Mg2+阻塞，當突觸前膜釋放谷氨酸時，激活的α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體，導致突觸后膜的部分去極化，從而NMDAR通道中的Mg2+被清除，NMDAR被激活，大量的Ca2+通過NMDAR通道流入導致細胞死亡[13]。生理情況下，谷氨酰胺合成酶可以將谷氨酸轉化為谷氨酰胺[14]。缺血和缺氧情況下，谷氨酸合成酶的表達量明顯下降，導致谷氨酸釋放引起的興奮性毒性持續存在[15]。谷氨酸的興奮性毒性可直接導致ICH大鼠的認知功能障礙[4]。本研究中，應用免疫熒光染色發現游泳可明顯減少大鼠海馬CA3區NMDAR的表達，進而減少谷氨酸的神經毒性。

本研究發現，游泳可明顯下調大鼠海馬中NR1和NR2B的表達，可能是其改善ICH大鼠認知功能(MWM實驗逃避潛伏期明顯縮短，目標象限時間明顯延長)的分子機制。NR1和NR2B 是NMDAR的兩個亞單位，均參與細胞死亡，該受體激活后導致興奮性毒性和神經細胞凋亡[16]。已有研究[17]發現ICH后繼發性炎癥與NR1亞單位的表達和磷酸化有關。NR1自身抗體可以減少缺血性卒中患者的腦梗死面積[18]。也有研究[19]證實，使用NR1疫苗或藥物降低NR1的表達也能保護腦卒中后的神經元，使神經元和樹突結構更加完整，降低興奮性毒性。有研究[20]報道，使用NR2B抑制劑后，可減輕谷氨酸誘導的興奮性毒性，保護腦梗塞后的神經元，減少梗塞面積，促進神經功能恢復。此外，文旬等[18]研究發現，NR2B拮抗劑能有效抑制腦梗塞大鼠的神經損傷，改善腦梗塞大鼠的空間記憶，提示抑制NR2B的表達有利于認知恢復。Zhen等[5]在腦出血動物模型研究中也發現，抑制NR2B表達有利于認知功能的恢復。因此，筆者推測NR2B受體的激活可能是ICH大鼠認知功能受損的重要機制，游泳可下調NR2B的表達，促進神經功能的恢復。

綜上所述，ICH后大鼠海馬區NMDAR激活，引起認知功能障礙。游泳可能通過下調NMDAR的NR1和NR2B亞基的表達，從而谷氨酸的興奮性毒性被抑制，改善ICH后的認知功能。