血漿外泌體circRNA診斷HCC聯合檢測模型的建立與驗證

孟 俊，王俊青，費曉春，顧志冬

（1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院檢驗科，上海 200025；2.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院普外科，上海 200025；3.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院病理科，上海 200025）

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床常見的惡性腫瘤之一。由于HCC臨床癥狀出現較晚，缺乏敏感的生物標志物用于早期診斷[1]，因此大多數患者在確診時已處于疾病晚期。目前，臨床上亟需可用于早期篩查和診斷HCC的新型標志物。外泌體是一種極具應用前景的新型液體活檢靶標，其作為一種細胞間信號傳遞的關鍵“中介”，在包括肝癌在內的多種惡性腫瘤進展過程中發揮重要作用[2]。目前，關于外泌體在HCC早期診斷中的研究仍較少。環狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種單鏈共價閉合的RNA。外泌體中含量較為豐富的非編碼RNA是微小RNA（microRNA，miRNA）和長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA），近年來發現circRNA也廣泛存在于外泌體中，這為進一步挖掘外泌體功能及作用機制提供了新的研究方向。由于circRNA具有強大的抗降解能力，因此具有巨大的臨床應用潛力[3]。GE等[2]的研究結果顯示，circRNA與肝癌的發生和發展密切相關，且可穩定地從患者外周血外泌體中富集。這表明檢測外泌體circRNA或可作為一種全新的肝癌早期診斷策略。本研究擬通過尋找HCC患者差異表達的circRNA，建立全新的、可用于HCC診斷的外泌體circRNA模型，并探討該模型在HCC診斷中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2017年1月—2019年6月上海交通大學附屬瑞金醫院接受根治性切除術的HCC患者256例（HCC組），根據入組時間，將HCC患者分為發現集（25例）、訓練集（126例）和驗證集（105例）。選取同期上海交通大學附屬瑞金醫院確診為乙型肝炎相關肝硬化患者100例（肝硬化組），其中訓練集50例、驗證集50例。另選取同期上海交通大學附屬瑞金醫院健康體檢者125名作為正常對照組，其中發現集25名、訓練集50名、驗證集50名。除性別外，訓練集和驗證集HCC患者臨床病理參數差異均無統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 訓練集與驗證集HCC患者臨床病理參數比較 例

1.2 入選和排除標準

1.2.1 入選標準 （1）HCC組：符合HCC病理學診斷標準，年齡≥18周歲，既往無其他惡性腫瘤病史，接受根治性切除術且臨床各項實驗室指標和病理檢查資料完整。（2）肝硬化組：既往有慢性乙型肝炎病史，影像學診斷明確具有肝硬化改變但無肝占位性病變。（3）正常對照組：體格檢查均正常，無乙型肝炎病史，無惡性腫瘤病史，實驗室檢查無異常。

1.2.2 排除標準 （1）HCC組：既往有惡性腫瘤病史，同時合并其他惡性腫瘤，臨床資料不完整，術后病理檢查證實非HCC，影像學資料缺失，拒絕簽署知情同意書。（2）肝硬化組：既往有惡性腫瘤病史，存在肝臟占位性病變，合并其他病毒性肝炎，肝硬化影像學診斷不明確。

1.3 方法

1.3.1 一般資料收集 收集所有HCC患者術前一般資料（年齡、性別、術前診斷、既往病史、腹水情況、肉眼癌栓、術前肝腎功能指標、乙型肝炎病毒感染狀態、AFP、癌胚抗原水平等）和術后臨床病理資料（肝硬化、腫瘤數、腫瘤大小、鏡下癌栓、衛星灶、包膜完整性、病理分級等）。所有術前血漿樣本均在患者治療前采集。

1.3.2 外泌體分離 采集所有對象外周血樣本6 mL，乙二胺四乙酸抗凝，2 h內1 200×g離心10 min，分離血漿，保存于-80 ℃，10 d內統一完成外泌體的分離和核酸的抽提、逆轉錄，并將模板凍存于-80 ℃。采用Invitrogen總外泌體分離試劑盒（美國Invitrogen公司）分離血漿外泌體，嚴格按試劑盒說明書操作。簡要步驟：將凍存的血漿2 000×g離心20 min，以去除細胞碎片，在2 mL血漿樣本中加入1 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）和600 μL外泌體分離試劑，混勻，4 ℃靜置30 min，然后4 ℃ 15 000×g離心5 min，去除上清液，即獲得外泌體沉淀。

1.3.3 circRNA檢測 使用Arraystar circRNA芯片（美國ARRASTAR公司）鑒定肝癌細胞系Hep3B和正常肝細胞系L02（購自中科院細胞庫）的外泌體來源circRNA表達的差異，用于后續發現集篩選。嚴格按說明書操作。

1.3.4 實時定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測 使用Trizol試劑（美國ThermoFisher Scientific公司）提取外泌體總RNA。使用Prime-Script RT試劑盒（日本TaKaRa公司）對提取的RNA進行逆轉錄。嚴格按試劑盒說明書操作。采用ABI 7500 PCR擴增儀（美國ABI公司）及SYBR試劑盒（日本TaKaRa公司）對特定circRNA的表達進行定量檢測。在發現集階段，采用2-ΔCq法對靶circRNA表達進行相對定量，以GAPDH為內參基因[5]。其中ΔCq靶circRNA=Cq靶circRNA-CqGAPDH。在訓練集和驗證集階段，根據2-ΔΔCq方法確定特定外泌體circRNA的表達水平，其中ΔΔCq=（ΔCq靶circRNA-正常對照組的平均ΔCq）。引物序列：c i r c_0 0 0 0 6 9 0 正向引物為5'-GAGACCCTCCACAAATTTGCA-3'，反向引物為5'-CCTCCCGGAACACCTCTG-3'；circ_0001359 正向引物為5'-CCTGGAATCACGAAGCACAG-3'；反向引物為5'-GTTGGGTAATACTGCCGCTG-3'；circ_0000396 正向引物為5'-CCTGGCAAACACTGGAATCC-3'，反向引物為5'-CAGCAAGCAGAGACGATCAC-3'；GAPDH 正向引物為5'- AGCCACATCGCTCAGACAC-3'，反向引物為5'- GCCCAATACGACCAAATCC-3'。

1.3.5 免疫印跡法檢測蛋白表達 采用全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基公司，目錄號KGP2100）提取血漿總蛋白。采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，試劑盒購自美國ThermoFisher Scientific公司。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對樣本中的蛋白進行分離，采用濕轉法（300 mA、120 min）將蛋白樣本轉移至聚偏氟乙烯膜，然后在4 ℃下與兔抗人CD9、CD63、CD81、Alix以及Calnexin抗體（美國Abcam公司，1∶500稀釋）孵育過夜。使用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（上海碧云天公司）孵育2 h，最后采用超敏化學發光試劑進行顯色，并定量分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件和GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用非配對Student t檢驗。計數資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價不同circRNA診斷HCC的效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌細胞系Hep3B和正常細胞系L02外泌體circRNA表達的差異

與正常細胞系L02比較，肝癌細胞系Hep3B中有102個exo-circRNA表達升高（P＜0.05）。將102個差異表達的外泌體circRNA與exoRBase數據庫中的HCC患者外周血外泌體cricRNA數據進行匹配，鑒定出4個在HCC患者血漿外泌體中表達量升高的circRNA，分別為circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396和circ_0000722。見圖1。

圖1 HCC患者外周血高表達外泌體circRNA篩選結果

2.2 HCC組、肝硬化組和正常對照組外泌體分離及circRNA表達的比較

免疫印跡法結果顯示，HCC組、肝硬化組和正常對照組血漿樣本均高表達CD9、CD63、CD81和Alix 4種外泌體標志物，無外泌體陰性標志物Calnexin表達。提示外泌體分離成功。見圖2。

圖2 血漿外泌體分離效果的免疫印跡法鑒定結果

采用RT-qPCR檢測HCC組和正常對照組發現集血漿外泌體中circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396和circ_0000722的表達量。結果顯示，HCC組血漿外泌體中circ_0000690、circ_0001359和circ_0000396的相對表達量顯著高于正常對照組（P＜0.05），circ_0000722相對表達量在2個組之間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 HCC組與正常對照組發現集4種血漿外泌體circRNA相對表達量的比較

2.3 HCC組、肝硬化組、正常對照組訓練集和驗證集隊列中circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396的表達情況

無論是訓練集還是驗證集，H C C組circ_0000690相對表達量均高于肝硬化組和正常對照組（P＜0.001）；正常對照組、肝硬化組、HCC組circ_0001359相對表達量依次升高（P＜0.05）；HCC組與肝硬化組之間circ_0000396相對表達量差異無統計學意義（P>0.05），但均高于正常對照組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 HCC組、肝硬化組、正常對照組訓練集和驗證集隊列中circ_0000690、circ_0001359和circ_0000396的表達情況

2.4 基于 circ_0000690、circ_0001359和circ_0000396的HCC診斷模型的構建

采用Logistic回歸分析建立基于circ_0000690、circ_0001359和circ_0000396診斷HCC的聯合檢測模型為：Logit（P）=1.110×circ_0000690+0.822×circ_0001359+0.622×circ_0000396-4.153。

無論是訓練集還是驗證集，HCC組聯合檢測模型的概率值均高于肝硬化組及正常對照組（P＜0.05），肝硬化組則高于正常對照組（P＜0.05）。早期HCC患者（巴塞羅那分期0+A期）聯合檢測模型的概率值與HCC患者整體的概率值比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖5。

圖5 HCC組、肝硬化組、正常對照組聯合檢測模型概率值的比較

2.5 circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項檢測及聯合檢測模型診斷HCC的效能

ROC曲線分析結果顯示，在訓練集中，circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項檢測及聯合檢測模型診斷H C C的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.802、0.726、0.621、0.859，診斷早期HCC的AUC分別為0.767、0.698、0.611、0.847。聯合檢測模型診斷HCC的效能優于AFP（P＜0.05）。見表2、表3和圖6。

圖6 circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項檢測及聯合檢測模型診斷訓練集中HCC的ROC曲線

表2 各項指標診斷訓練集HCC的ROC曲線參數

表3 各項指標診斷訓練集早期HCC的ROC曲線參數

2.6 circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項檢測及聯合檢測模型診斷HCC的驗證

ROC曲線分析結果顯示，在驗證集中，circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項檢測及聯合檢測模型診斷HCC的AUC分別為0.752、0.663、0.615、0.847，診斷早期HCC的AUC分別為0.763、0.673、0.591、0.845。聯合檢測模型診斷HCC的效能優于AFP（P＜0.05）。見表4、表5和圖7。

表4 各項指標診斷驗證集HCC的ROC曲線參數

表5 各項指標診斷驗證集早期HCC的ROC曲線參數

圖7 circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項檢測及聯合檢測模型診斷驗證集HCC的ROC曲線

2.7 circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項檢測及聯合檢測模型診斷AFP陰性HCC的效能

將AFP＜20 ng/mL定義為AFP陰性。ROC曲線分析結果顯示，在訓練集中，circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項檢測及聯合檢測模型診斷AFP陰性HCC的AUC分別為0.810、0.695、0.588、0.894；診斷AFP陰性早期HCC的AUC分別為0.786、0.672、0.574、0.877。見表6、表7和圖8。

圖8 circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項檢測及聯合檢測模型診斷訓練集AFP陰性HCC的ROC曲線

表6 各項指標診斷訓練集AFP陰性HCC的ROC曲線參數

表7 各項指標診斷訓練集AFP陰性早期HCC的ROC曲線參數

在驗證集中，circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項檢測及聯合檢測模型診斷AFP陰性HCC的AUC分別為0.702、0.670、0.641、0.840；診斷AFP陰性早期HCC的AUC分別為0.747、0.669、0.587、0.846。見表8、表9和圖9。

圖9 circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項檢測及聯合檢測模型診斷驗證集AFP陰性HCC的ROC曲線

表8 各項指標診斷驗證集AFP陰性HCC的ROC曲線參數

表9 各項指標診斷驗證集AFP陰性早期HCC的ROC曲線參數

3 討論

近年來，越來越多的學者致力于探索外泌體在腫瘤中的診斷潛力，外泌體circRNA在腫瘤診斷和預后評估中的作用引起了學者們的廣泛關注[5]。外泌體可有效保護內含的circRNA免受RNA酶降解，維持其穩定性和完整性[6]。因此，外泌體circRNA被認為是多種實體腫瘤早期診斷和預后評估的理想生物標志物。已有多項研究證實血漿外泌體circRNA可用于胃癌、結直腸癌、卵巢癌、前列腺癌等實體腫瘤的診斷[7]。對于肝癌，已有少量研究提示外泌體circRNA可作為潛在的診斷標志物。LYU等[8]的研究結果顯示，血漿circ_0070396可用于肝癌的診斷。SUN等[9]報道了1種可用于肝癌診斷的包含3個外泌體circRNA（hsa_circ_0004001、hsa_circ_0004123、hsa_circ_0075792）的分子組合。但這些研究尚存在一定的不足，如單個標志物相對于AFP診斷效能提高不顯著、樣本量較小（＜100例）、缺乏獨立驗證等。本研究納入較大樣本量，構建了一個含3種circRNA（circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396）的HCC診斷聯合檢測模型。該模型診斷HCC的AUC為0.886，敏感性為76.98%，特異性為87.00%，具有較好的診斷效能；獨立驗證結果顯示，本研究建立的聯合檢測模型可用于HCC的診斷。但本研究用于建立聯合檢測模型的3種circRNA在肝癌中的生物學作用及其臨床價值目前尚未見報道，其在肝癌發生、發展中的作用尚不明確。

目前，AFP仍是HCC診斷中應用最廣泛的生物標志物，但AFP的敏感性較低，特別是在早期肝癌中，特異性也不足，有近20%的肝硬化患者AFP異常升高，且此升高現象與惡性腫瘤的發生無顯著相關性[10]。因此，臨床亟需一種診斷肝癌較為靈敏的生物標志物。本研究結果顯示，基于3種circRNA建立的聯合檢測模型在AFP陰性HCC患者中的陽性率（敏感性）與肝癌患者整體陽性率（敏感性）基本一致，在訓練集中，聯合檢測模型診斷AFP陰性HCC的AUC為0.894，敏感性為81.25%，特異性為87.00%；在驗證集中，聯合檢測模型診斷AFP陰性HCC的AUC為0.840，敏感性為74.47%，特異性為90.00%。提示聯合檢測模型對AFP陰性HCC具有良好的診斷效能。

難以早期診斷是目前肝癌預后不良的重要原因[11]。準確的早期診斷可大大提高肝癌患者行根治性切除術的比例，切實提高臨床療效。然而，目前臨床仍缺乏有效的肝癌早期診斷策略。本研究ROC曲線分析結果顯示，在訓練集中，基于 circ_0000690、circ_0001359和circ_0000396建立的聯合檢測模型診斷早期HCC的AUC為0.859；在驗證集中，聯合檢測模型診斷早期HCC的AUC為0.847。由此可見，聯合檢測模型對早期HCC有較好的診斷效能。

無論是對早期HCC，還是對APF陰性HCC，本研究建立的聯合檢測模型均表現出較好的診斷效能。由于本研究入組的肝硬化患者例數較少，后續將納入更多的肝硬化患者，并開展前瞻性研究，觀察聯合檢測模型在預測肝癌早期發生中的價值。此外，由于本研究納入的3種外泌體circRNA（circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396）的生物學功能尚不明確。因此，闡明這3種circRNA的來源，并研究其生物學功能也將是下一步研究的目標。

本研究尚存在一些局限之處：（1）入組的患者例數雖然較多，但仍顯不足，需要納入更多的HCC患者來進一步驗證本研究得出的結果；（2）納入的HCC患者多為乙型肝炎相關肝癌，因此需要納入不同疾病背景的肝癌患者，以確認聯合檢測模型的普適性；（3）考慮到乙型肝炎相關肝硬化是乙型肝炎患者發生肝癌過程中至關重要的一項病理生理性改變，而乙型肝炎相關肝硬化是肝癌發生的重要危險因素，因此在未來的研究中將納入更多的慢性乙型肝炎（無肝硬化）患者，從而對本研究結果進行更為細致的分層驗證。

綜上所述，基于3種circRNA（circ_0000690、circ_0001359和circ_0000396）構建的聯合檢測模型對HCC具有較好的診斷效能，亦適用于早期HCC和AFP陰性HCC的鑒別診斷，有助于提升臨床對HCC的診斷和鑒別診斷效率，有利于改善HCC患者的預后。此外，在后續研究中，我們將進一步圍繞這3個外泌體circRNA進行分析，旨在明確其生物學功能，從而為肝癌的治療提供全新靶點。