孕期和哺乳期暴露重鉻酸鉀對仔鼠卵巢損傷的影響*

管慶美，劉燕群,△，吳 倩，林可欣，魯雄兵，張 龍，陳路鋒

(1.江漢大學醫學院,湖北 武漢 430056；2.江漢大學持久性有毒污染物環境與健康危害湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430056)

鉻一直被認為是人和動物的必需微量元素，也被廣泛用于金屬冶煉、皮革制造、化妝品生產、人工關節等各個行業。然而鉻也是環境重金屬污染物，可通過多種途徑蓄積于體內，造成機體損傷。在不同價態鉻之間以六價鉻毒性作用尤為嚴重[1-2]。六價鉻也被WHO定為人類確定致癌物，過量攝入鉻會造成肝臟、腎臟、骨骼、皮膚、神經系統損傷[3-7]，甚至有致癌、致突變等不良影響，并且重鉻酸鉀對胚胎、子一代機體損傷也已被證實[8-9]。然而重鉻酸鉀對子一代生殖器官損傷的研究甚少見，具體機制尚不明確。因六價鉻可穿過細胞膜，且具有強氧化性，可損傷卵黃囊，也可穿過胎盤屏障，且母乳喂養也可傳播鉻離子，合并對仔鼠造成臟器損傷[10-11]。提示六價鉻宮內暴露會對雌性仔鼠卵巢產生氧化應激效應，造成潛在的生殖發育毒性。故本研究建立了重鉻酸鉀染毒模型，觀察了對子一代雌鼠的氧化損傷效應。SD大鼠因其具有個體差異小、試驗數據較準確等優點,廣泛用于動物實驗研究[12]。本研究選用SD大鼠，通過將妊娠期、哺乳期雌性大鼠暴露于不同濃度重鉻酸鉀，觀察了子一代雌性仔鼠性成熟時期卵巢的氧化應激水平，對母鼠孕期和哺乳期暴露重鉻酸鉀對子一代仔鼠卵巢氧化損傷的影響進行了初步探討，旨在為重金屬致子一代雌性仔鼠生殖毒性的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 2019年6月選取無特定病原體級SD大鼠雌性23只，雄性10只，均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司(合格證號：1100111911015206)。大鼠毛發濃密有光澤，身體狀況良好。將大鼠雌雄分開并置于室內(24±1)℃適應性喂養1周。

1.1.2儀器與試劑 重鉻酸鉀產于山東西亞化學股份有限公司，純度99.8%；JA2003B電子天平購自上海越平科學儀器有限公司，XD-202倒置生物顯微鏡購自南京江南永新，離心機購自上海越平科學儀器有限公司，臺式離心機(TGL-16C)、純水儀(AJC-0501-P)、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1配制重鉻酸鉀染毒液 準確稱取適量重鉻酸鉀配制成1/2、1/4、1/8 LD50重鉻酸鉀溶液分裝至氯化聚氯乙烯管中，置于冰箱(4 ℃)保存，以供低、中、高濃度染毒組灌胃使用。

1.2.2實驗動物分組與實驗方法

1.2.2.1預實驗 因六價鉻LD50濃度為171.00 mg/kg[13]。故設置1/2 LD50(85.5 mg/kg)、1/4 LD50(42.75 mg/kg)、1/8 LD50(21.375 mg/kg)濃度染毒組及生理鹽水對照組。每組2只雌鼠，1只雄鼠。在適應性喂養結束后于09：00合籠，雌雄比例為2∶1。第2天09：00進行陰道涂片檢測雌鼠是否成功受孕。以顯微鏡下觀察到精子為妊娠第0天并記錄體重，第1天起開始灌胃。各組孕鼠按0.01 mL/g劑量灌胃,從孕1～19 d每天上午08：30稱重后根據體重調整劑量，每天灌胃劑量一次性完成，自由飲水、進食，直至生出仔鼠后斷奶。斷奶后對仔鼠進行觀察，斷頭取血，并取其卵巢，濾紙脫水，稱重，分析確定正式實驗重鉻酸鉀濃度。

1.2.2.2正式實驗 根據預實驗結果，1/2、1/4、1/8 LD50重鉻酸鉀溶液對卵巢具有一定影響，且老鼠存活率較高。故正式實驗依舊采用此濃度重鉻酸鉀溶液。根據預實驗方法將雌鼠分為低(1/8 LD50)、中(1/4 LD50)、高(1/2 LD50) 濃度染毒組(各4只)和對照組(3只)。 將大鼠按雌雄比例2∶1合籠，按預實驗方法測定雌鼠妊娠日期并記錄，并于妊娠第1天起按0.01 mL/g劑量開始灌胃，每天1次，連續灌胃至仔鼠出生后斷奶(19 d)。對照組仔鼠(不分雌雄)27只,低濃度染毒組37只,中濃度染毒組33只,高濃度染毒組48只。每組挑取體重、毛色、生理狀態相似的8只雌性仔鼠繼續喂養(自由飲水、進食)至45 d(性成熟)后稱重、麻醉剖取卵巢組織，濾紙脫水，稱重計算臟器系數。每組取6只雌性仔鼠測定卵巢組織勻漿SOD 、GSH-Px 活力。

1.2.3觀察指標

1.2.3.1仔鼠體重、卵巢重量及臟器系數 各組仔鼠出生45 d使用7%水合氯醛麻醉，稱重并處死仔鼠，迅速分離雙側卵巢組織，用濾紙吸干，進行稱量并計算卵巢系數(卵巢重量/體重×100%)。

1.2.3.2卵巢SOD、GSH-Px活力 稱取各組仔鼠適量卵巢組織用9倍勻漿介質研磨，然后將研磨液3 000～4 000 r/min離心10 min，用移液槍取上清液制備成10%組織勻漿，各試劑反應時間與劑量和操作步驟嚴格按試劑盒說明書操作，采用分光光度法測定SOD、GSH-Px活力。

2 結 果

2.1各組仔鼠一般情況比較 對照組仔鼠精神狀態良好，毛色正常，活潑好動，反應迅速，食欲正常，體重不斷增加，無明顯異常情況。隨染毒時間延長，中、高濃度染毒組仔鼠食欲減退，較為安靜，體重增長緩慢，較對照組低；仔鼠毛色由純白、有光澤變得偏黃、無光澤，且以高濃度染毒組最為明顯。

2.2各組仔鼠體重、卵巢重量及臟器系數比較 與對照組比較，低濃度染毒組仔鼠體重較高，而中、高濃度染毒組仔鼠體重明顯較低，且高濃度染毒組較為明顯，不同濃度染毒組仔鼠卵巢系數均明顯降低，且隨染毒濃度升高仔鼠卵巢重量及臟器系數均呈下降趨勢，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組仔鼠體重、卵巢重量及臟器系數比較

2.3各組仔鼠卵巢組織SOD、GSH-Px活力比較 與對照組比較，中、高濃度染毒組仔鼠卵巢 GSH-Px活力明顯降低，不同濃度染毒組仔鼠卵巢SOD活力均明顯降低,且隨染毒濃度升高仔鼠SOD、GSH-Px活力均呈下降趨勢，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組仔鼠卵巢組織SOD、GSH-Px活力比較

3 討 論

卵巢是卵泡的生長、發育場所，其受損必將影響生殖能力。實驗動物的臟器系數可反映毒物對動物某臟器的綜合毒性損傷作用，臟器系數下降表示臟器萎縮和退行性病變[14]。本研究結果顯示，與對照組比較，中、高濃度染毒組仔鼠體重較輕，以高濃度染毒組較為明顯。且不同濃度染毒組仔鼠卵巢重量及系數均明顯下降，且以高濃度染毒組最為明顯，說明重鉻酸鉀孕期、哺乳期暴露對仔鼠生殖發育造成了毒性損傷。

活性氧歧化物是超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫及其中間代謝產物的總稱,在細胞內含量高低反映了細胞內氧化應激的水平。六價鉻可使機體產生大量活性氧歧化物[15],內源性抗氧化劑——SOD、GSH-Px是機體抗氧化防御系統的重要組成部分，SOD能清除超氧陰離子自由基,將其歧化為氧氣和過氧化氫,被稱為生物體抗氧化系統的第一道防線；作為抵御氧化損傷的第二道防線的GSH-Px能進一步將過氧化氫轉化成水和氧氣,保護細胞膜結構及功能不受過氧化物的干擾及損害[16]。因此，測定SOD、GSH-Px活力能間接反映生物體內清除活性氧的能力。本研究結果顯示，與對照組比較，中、高濃度染毒組仔鼠卵巢GSH-Px活力明顯降低，不同濃度染毒組小鼠卵巢SOD活力均明顯降低，提示鉻進入細胞膜后其強氧化性引發氧化應激產生了大量氧自由基，超出了機體清除能力，SOD、GSH-Px活力下降,致使組織受到活性氧攻擊而產生損傷。

綜上所述，重鉻酸鉀孕期、哺乳期暴露可致仔鼠卵巢發生不同程度氧化損傷，但對雌性生殖系統的具體機制尚需進一步探討，仍需加強這方面的研究。