基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術的明日葉化學成分鑒定

張 燁，鄧 琦，魏 敏，付常清，張 旭*

(1.成都中醫藥大學 藥學院，四川 成都 611137；2.四川康和鼎盛大健康產業集團有限公司，四川 成都 610000；3.四川斯力健農業科技有限公司，四川 成都 641400)

明日葉(Angelica keiskei)為傘形科當歸屬多年生草本植物，味甘，性溫，歸心、肝、大腸經[1]。現代藥理學研究表明，其化學成分包括查爾酮、黃酮、香豆素、萜類等，具有增強人體免疫力、抗潰瘍、抗血栓、降膽固醇、降血脂、防癌變等功效。

明日葉含有與人類健康密切相關的多種生理功效成分，極具開發價值。目前，我國明日葉僅南方種植產區種植，面積約1萬hm2，年產量500 kg左右[4]，其產品(明日葉保健茶、保健飲料、保健膠囊等)在市場流通[5]。近年來，已有研究采用多種色譜方法對明日葉化學成分進行了化合物分離，但得到的化合物不超過20個；使用超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)對明日葉進行成分鑒定，僅鑒定了10余個查爾酮類成分。此外，關于明日葉的藥效物質基礎研究主要集中于查爾酮類化合物上，對明日葉質量評價也以測定查爾酮類化合物中的4-羥基德里辛和黃色當歸醇含量為主[14]。但明日葉化學成分復雜，僅少數查爾酮類成分難以對其質量及藥效進行全面、精準地評價，且尚無關于明日葉的系統化學成分研究，基于此，建立一種靈敏、快速、準確的方法全面分析鑒定明日葉中的化學成分，對其質量標準提升和藥效物質基礎研究具有現實意義。

本實驗采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(Ultra-High Performance Liquid Chromatography Coupled with Hybrid Quadrupole-Orbitrap High-Resolution Mass Spectrometry，UPLC-Q-Orbitrap HRMS)技術對明日葉的化學成分進行快速分析，共鑒定了68個化合物，可為明日葉及其產品的質量評價及藥效物質基礎研究提供理論依據和方法學參考，現報道如下。

1 材料

1.1 儀器

Vanquish型超高效液相色譜聯用Q-Exactive型四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，BT-40E型超聲波清洗器(成都雅源科技有限公司)，BAS124S型1/1萬電子天平和BT125Max型1/10萬分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)，SL-100型高速多功能粉碎機(上海冰都電器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

對照品：均購于成都埃法生物科技有限公司，包括補骨脂素、花椒毒素、異補骨脂素、佛手苷內酯、7-去甲基軟木花椒素、異歐前胡素、水合氧化前胡素、甘草素、蔗糖(批號分別為AF9061521、AF9-022001、AF20071051、AF20060853、AF9121302、AF20021922、AF9111051、AF20050152、AF2007-1052，質量分數均≥98%。甲醇、甲酸均為色譜純，分別購自美國Fisher公司和德國CNW科技公司；水為純凈水，購自杭州娃哈哈集團有限公司。

1.3 藥材

明日葉(批號：20200603)購于四川斯力建農業科技有限公司，經成都中醫藥大學藥學院龍飛副教授鑒定為多年生草本植物傘形科當歸屬明日葉(Angelica keiskei)的干燥莖葉。

2 方法

2.1 色譜條件

WatersACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相為0.1%甲酸溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫：0-6 min，20%B～50%B；7-12 min，65% B～75% B；13-23 min，90% B～100% B；23-28 min，100%B；流速：0.15 mL/min；柱溫：30 ℃，進樣量：3 μL。

2.2 質譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，正、負離子監測模式；質量掃描范圍m/z100～1 500；裂解電壓(+)3.50 kV、(-)3.00 kV；鞘氣流速35 L/min；輔助氣流量10 L/min；離子傳輸管溫度320 ℃；輔助氣溫度350 ℃；掃描模式：Full MS/dd-MS2；Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500。MS/MS模式時，正離子模式下的碰撞能分別為20、40、60 eV，負離子模式下的碰撞能分別為20、40、60 eV。

2.3 供試品溶液制備

將干燥的明日葉粉碎，稱取適量本品粉末(過二號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，浸泡1 h，超聲處理(250 W、40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，進樣前用0.22 μm 微孔濾膜濾過。

2.4 對照品溶液配制

取補骨脂素、花椒毒素、異補骨脂素、佛手苷內酯、7-去甲基軟木花椒素、異歐前胡素、水合氧化前胡素、甘草素、蔗糖對照品適量，加甲醇超聲溶解，定容至25 mL，配置成質量濃度約為0.05 mg/mL的單一對照品溶液置于4 ℃冰箱中保存，進樣前過0.22 μm微孔濾膜。

2.5 數據處理

將高分辨質譜采集的原始數據導入Thermo Compound Discover(CD)3.0分析軟件進行初步計算，設置CD向導、創建方法模板，建立未知化合物的鑒定流程，對采集的原始數據進行峰對齊和峰提取，結合mzCloud、mzVault、Chemspider網絡數據庫及本地中藥成分數據庫OTCML，將提取得到的分子離子色譜峰、同位素峰擬合出可能的分子式，與特征碎片離子信息實測譜圖進行匹配。對匹配出的結果設置過濾參數：峰面積閾值80 000，一級及二級質量偏差不得大于5×10-6，匹配度分值高于80，從而初步篩選得出明日葉中可能存在的化合物。對篩選得到的離子及數據庫中的化合物信息與相關文獻或對照品進行比對，進行化合物分析鑒定[15]。

3 結果

3.1 UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析結果

取上述供試品溶液，按“2.2項下條件”對明日葉甲醇提取液在正離子模式下的總離子流色譜見圖1；在負離子模式下的總離子流色譜見圖2。在正、負離子模式下，供試品溶液分離效果及離子化效率良好。

圖1 明日葉甲醇提取液UPLC-Q-Orbitrap HRMS正離子模式總離子流色譜

圖2 明日葉甲醇提取液UPLC-Q-Orbitrap HRMS負離子模式總離子流色譜

3.2 UPLC-Q-Orbitrap HRMS鑒定結果

本實驗從明日葉中共鑒定了68個化合物，包含12個查爾酮類，17個黃酮類，18個香豆素類，1個萜類，2個寡糖類，5個氨基酸類，6個有機酸類，7個其他類化合物，其中34個成分首次從明日葉中鑒定得到。對明日葉甲醇提取液進行正離子模式分析鑒定的成分見表1；負離子模式分析鑒定的成分見表2。

表1 明日葉甲醇提取液UPLC-Q-Orbitrap HRMS正離子模式總離子流色譜

表2 明日葉甲醇提取物UPLC-Q-Orbitrap HRMS負離子模式數據及成分鑒定

3.3 UPLC-Q-Orbitrap HRMS化學成分的質譜解析

3.3.1 查爾酮類化合物的裂解特征 查爾酮類化合物是明日葉主要活性成分[5]。本實驗從明日葉甲醇提取液中共鑒定了12個查爾酮類化合物，包括7種黃色當歸醇以及其他5種查爾酮苷元。在質譜碎裂過程中，查爾酮類化合物的斷裂方式主要發生RDA裂解和丟失HCHO等中性離子。以化合物39為例，正離子模式下形成質子化準分子離子[M+H]+m/z339.1593，預測其分子式為C21H22O4，在二級質譜中可見其發生RDA裂解，形成碎片離子[M+H-C4H8]+m/z283.096 6，[1，3A+H]+m/z181.049 7，[1，4B+H]+m/z163.039 1，[1，4B+H-HCHO]+m/z133.028 6。根據化合物的二級質譜裂解特征，經數據庫檢索并與文獻比對，推斷其為4-羥基德里辛，裂解規律見圖3。

圖 3 4-羥基德里辛質譜裂解途徑

3.3.2 黃酮類化合物裂解特征 黃酮類化合物在植物界分布廣泛[2]，在植物體內其大部分與糖結合成苷類或以碳糖基的形式存在，也有以游離形式存在的。本實驗從明日葉甲醇提取液中共鑒定了17個黃酮類化合物，包括8種黃酮苷及9種黃酮苷元，其中，甘草素經與對照品比對而準確鑒定。黃酮類化合物在質譜條件下的斷裂方式主要有CO、CO2、H2O等中性離子丟失與1，3A+、0，2A+、1，3B+、0，2B+等RDA裂解及糖基的斷裂[16]。以化合物23為例，正離子模式下形成質子化準分子離子[M+H]+m/z257.080 9，預測其分子式為C15H12O4，在二級質譜中可見其發生RDA裂解，形成碎片離子[1，4B-H2+H]+m/z147.044 2，[1，3A+H]+m/z137.023 5，[1，4B-H2+H-CO]+m/z119.049 5。根據化合物的二級質譜裂解特征，經數據庫檢索及與對照品保留時間比對，鑒定其為甘草素，裂解規律見圖4。

圖 4 甘草素質譜裂解途徑

3.3.3 香豆素類化合物的裂解特征 香豆素類化合物是明日葉的藥效成分之一[2]。本實驗從明日葉甲醇提取液中共鑒定了18個香豆素類化合物，包括4種簡單香豆素，8種線性香豆素，2種角型呋喃香豆素，2種線性吡喃香豆素和2種角型吡喃香豆素。香豆素類化合物由于有較好的共軛系統，在ESI電噴霧質譜中，其斷裂方式主要有CO、CO2等中性離子的丟失。例如：化合物18在正離子模式下形成質子化準分子離子[M+H]+m/z305.102 1，預測其分子式為C16H16O6，二級質譜中可見[M+H-C5H10O2]+m/z203.033 9，[M+H-C5H10O2-CO-CO]+m/z147.044 2，[M+H-C5H10O2-CO-CO2]+m/z131.049 4。根據化合物的二級質譜裂解特征，經過數據庫檢索及與對照品保留時間比對，鑒定其為水合氧化前胡素，裂解規律見圖5。

圖5 水合氧化前胡素質譜裂解途徑

3.3.4 萜類化合物的裂解特征 明日葉中萜類成分也具有藥理作用[2]。本實驗從明日葉中鑒定了1個萜類化合物，化合物35在正離子模式下形成質子化準分子離子[M+H]+m/z235.169 4，預測其分子式為C15H22O2，二級質譜中可見[M+H-O]+m/z219.137 5，[M+H-O-C3H4]+m/z179.106 8。根據化合物的二級質譜裂解特征，經過數據庫檢索及與文獻比對，推斷其為Ashitabaol A，裂解規律見圖6。

圖 6 Ashitabaol A質譜裂解途徑

3.3.5 寡糖類化合物的裂解特征 本實驗從明日葉中共鑒定了2個寡糖類化合物。寡糖類二級質譜裂解特征主要為丟失H2O。以化合物43為例，負離子模式下形成準分子離子[M-H]-m/z341.108 9，預測其分子式為C12H22O11，二級質譜中可見[M-H-C6H10O5]-m/z179.055 6，[M-H-C6H10O5-H2O]-m/z161.044 9，根據化合物的二級質譜裂解特征，經過數據庫檢索及與對照品保留時間比對，鑒定其為蔗糖，裂解規律見圖7。

圖7 蔗糖質譜裂解途徑

3.3.6 氨基酸類化合物的裂解特征 本實驗從明日葉中共鑒定了5個氨基酸類化合物。二級質譜裂解特征主要為丟失NH3、HCOOH中性離子。以化合物4為例，正離子下可形成質子化準分子離子[M+H]+m/z166.086 2，預測其分子式為C9H11NO2，二級質譜中可見[M+H-NH3]+m/z149.059 7，[M+H-HCOOH]+m/z120.081 0，[M+H-NH3-HCOOH]+m/z103.0547，根據化合物的二級質譜裂解特征，經過數據庫檢索及與文獻[17]比對，推斷其為苯丙氨酸，裂解規律見圖8。

圖8 苯丙氨酸質譜裂解途徑

3.3.7 有機酸類化合物的裂解特征 本實驗從明日葉中共鑒定了6個有機酸類化合物，二級質譜裂解特征主要丟失H2O、CO2中性離子。例如，化合物58在負離子模式下形成準分子離子[M-H]-m/z201.112 7，預測其分子式為C10H18O4，二級質譜中可見[M-H-H2O]-m/z183.102 1，[M-H-H2O-CO2]-m/z139.112 0，根據化合物的二級質譜裂解特征，經數據庫檢索及與文獻[18]比對，推斷其為癸二酸，裂解規律見圖9。

圖9 癸二酸質譜裂解途徑

4 結論

本實驗基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術，選擇流動相0.1%甲酸溶液-甲醇梯度洗脫，并對明日葉中的化學成分進行了分析鑒定。通過比較明日葉中的化合物在正、負離子模式下的總離子流圖，發現正、負離子模式下均有較好的響應，較為全面地闡明了明日葉的化學物質基礎，可為其質量評價及藥效物質基礎研究提供理論依據和方法學參考。

從鑒定結果看，本實驗從明日葉中初步鑒定了68個化合物，其化學成分大致分為7大類，其中查爾酮類、黃酮類、香豆素類成分具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗動脈粥樣硬化、抗糖尿病、降血壓、降膽固醇和改善神經系統功能等藥理活性[5]，提示明日葉極具開發前景。與已報道的明日葉化學成分研究相比，34個成分首次從明日葉中鑒定得到，進一步豐富、完善了明日葉的化學成分庫。此外，已鑒定的花椒毒素、美洲花椒素、佛手酚和絲立尼亭等香豆素類化合物，葛根素等黃酮類化合物質譜響應值高，且這些化合物分別具有降糖、抗炎[25]、防癌[26]等藥理活性，可考慮作為明日葉質量評價的候選指標。