閩產細葉石仙桃顯微鑒別及總氨基酸含量測定

于虹敏，陳小霞，洪 旖，盧澤雨，范世明，溫秀萍，林 羽

(福建中醫藥大學，福建 福州 350122)

細葉石仙桃是蘭科石仙桃屬植物細葉石仙桃PholidotacantonensisRolfe.的假鱗莖或全草，生于林中或蔭蔽處的巖石上，主產于浙江、江西、福建、臺灣、湖南、廣東和廣西[1]。為民間常用的中草藥，具有清熱潤燥、化痰止咳、滋陰解毒、涼血止痛等功效[2]。細葉石仙桃常作為石斛偽品使用，僅《上海市中藥材標準》收錄，尚未被《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)收錄，質量標準只有性狀鑒別。細葉石仙桃作為閩南地區藥食兩用的藥材，深受人們喜愛[3]。植物作為人類重要的食物來源，也是我們人類獲取總氨基酸的主要途徑之一[4]，人類對氨基酸類物質的需求在不斷的上升。經查閱文獻資料可知，細葉石仙桃含有黃酮類、氨基酸類等多種化學成分，其研究主要集中于化學成分和藥理作用方面，缺乏對其藥用全草的生藥學鑒別；有關于部分蘭科植物總氨基酸含量測定的研究，如石斛、芳香石豆蘭等[5]，但未見關于石仙桃中總氨基酸含量測定研究。福建省石仙桃屬植物僅有石仙桃和細葉石仙桃2種，現對細葉石仙桃進行顯微鑒別，并初步檢測其總氨基酸含量，以期為細葉石仙桃的質量評價提供參考依據。

1 材料與試藥

紫外可見分光光度計UV9000(上海元析儀器有限公司)，生物顯微鏡(OLYMPUS CX31，奧林巴斯(中國)有限公司)；實地調查采集8批(福建省順昌縣2批次、屏南縣2批次、永春縣2批次、武夷山市2批次)細葉石仙桃樣品(以全草鮮品為采收標準)，經福建中醫藥大學藥學院范世明正高級實驗師鑒定為蘭科植物細葉石仙桃PholidotacantoniensisRolfe的全草；甘氨酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：140624-201506)；其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別

取順昌縣全株鮮品，除去雜質，洗凈，置于-4 ℃冰箱保存備用。選取新鮮細葉石仙桃的根、根莖、假鱗莖、葉等組織部位進行徒手切片及表面制片；另取部分鮮品，用開水燙后，置于105 ℃烘箱烘干至恒重，粉碎，過20目篩，置于干燥器中儲存備用。取少量樣品粉末，放置于載玻片上，經過水合氯醛加熱透化或不經透化，制作粉末制片。將所有制片置于數碼一體顯微鏡下觀察、拍攝，采用圖像處理軟件記錄顯微特征，進行文字描述并繪畫。

2.1.1 根橫切面顯微特征 呈類圓形，直徑750～967 μm，根被細胞2～4 層，類圓形，壁稍厚，老根根被常脫離皮層；外皮層為一列細胞，類五邊形或六邊形，長11～25 μm，寬20～37 μm，細胞壁呈馬蹄形增厚，厚約 3.3 μm；皮層3～4層，薄壁細胞大小懸殊，靠近外皮層和內皮層處的一列細胞較小，類圓形至類橢圓形，大小約 15 μm，胞內含較多草酸鈣簇晶，大小3.5～5 μm，其余皮層細胞大小約 40 μm，在靠近內皮層處可見具紋孔薄壁細胞；內皮層為一列類五邊形或六邊形細胞，長10～22 μm，寬 15～31 μm，細胞壁極度增厚，胞腔極小且偏外側；中柱占整體的1/2，中柱內木質部束與韌皮部束相間排列呈放射狀，韌皮部束約 11 個，周圍有1～3 層纖維束包圍，木質部束常對應內皮層的一個薄壁通道細胞；髓部不明顯，細胞類圓形，壁稍厚。見圖 1。

注：1.根被；2.外皮層；3.皮層；4.通道細胞；5.內皮層；6.木質部；7.韌皮纖維；8.韌皮部；9.髓部。

2.1.2 根狀莖橫切面顯微特征 呈類圓形，皮層多處破碎，細胞不規則形，壁稍增厚，胞內偶見草酸鈣針晶和簇晶，內外皮層細胞不明顯；中柱寬廣，基本組織為類圓形細胞，細胞間隙明顯，可見具紋孔細胞，大小 18～61 μm，胞內偶見淀粉粒；中柱散有約110個外韌型維管束，維管束呈類圓形或橢圓形，大小48～207 μm，靠近外圍的維管束有時可見兩個連接成一個，木質部相連，韌皮纖維相連。維管束在排列呈新月形或半圓形，纖維外側可見硅質塊。見圖 2。

注：1.皮層；2.維管束；3.纖維及硅質塊；4.中柱；5.韌皮部；6.木質部。

2.1.3 假鱗莖橫切面顯微特征 形狀不規則，直徑0.9～1.4 cm，邊緣為深淺不一的波紋。表皮細胞一列，類長方形，紅棕色，細胞壁增厚，外側壁厚約4 μm，無角質層。基本組織中，薄壁細胞類圓形或不規則形，不規則排列，大小懸殊，胞內含淀粉粒，大小 5～10 μm，可見草酸鈣簇晶和針晶束，有樹脂道和具紋孔薄壁細胞；散在約65個外韌型維管束，大小50～267 μm，木質部導管大小不一，韌皮部較小，韌皮部周圍有新月形纖維群包圍，1～8層纖維細胞組成，體積較大的維管束在纖維群外側常附著半圓形的硅質塊，直徑約3.3 μm，并有1個明顯空腔，大小 32～130 μm。見圖 3。

注：1.表皮；2.薄壁細胞；3.木質部；4.韌皮部；5.纖維束及硅質塊。

2.1.4 葉橫切面顯微特征 等面葉，主脈稍凹陷，一對側脈凸出。上下表皮均被角質層，厚約1.7 μm，均具1～2個非腺毛，為單細胞，向葉肉凹陷，不凸出表皮。上表皮細胞一列，下表皮細胞一列，類五邊形，長 17～47 μm，寬23～41 μm，含氣孔約16個，由3～5個石細胞組成。葉肉組織分化不明顯，可見具紋孔細胞。葉綠體均勻分布，黏液細胞類圓形，內含草酸鈣簇晶，大小約 3.5 μm，可見草酸鈣針晶束，偶見方晶，維管束外韌型，約21 個，主脈處維管束較小，側脈一對維管束最大，大維管束含環繞形纖維群，兩端6～8 層，纖維內偶見晶體。見圖 4。

注：1.角質層；2.上表皮；3.非腺毛；4.纖維束；5.木質部；6.葉肉組織；7.韌皮部；8.下表皮；9.氣孔。

2.1.5 粉末顯微特征 全草粉末呈淺棕色。①氣孔不定式，副衛細胞 3～5 個，長 25～53 μm，寬 8～33 μm，也有平軸式氣孔；②石細胞紅棕色，長約 50～75 μm，寬約 25～50 μm，壁極厚，胞腔極小；③木纖維長條形，直徑至 17 μm，長150～208 μm，壁稍厚，木化，孔溝明顯；④散有較多淀粉粒，大小5～36 μm；⑤草酸鈣簇晶眾多，棱角尖銳，直徑 3～10 μm；⑥草酸鈣針晶成束或散在，束長30～46 μm，針晶長短懸殊，8～43 μm；⑦導管有螺紋導管、環紋導管以及偶見具緣紋孔導管，螺紋導管稍多，直徑約 17 μm，長約 200 μm，具緣紋孔導管片段較小，寬約 17 μm，長約 27 μm；⑧可見較多薄壁細胞碎片，為具紋孔薄壁細胞，類橢圓形，寬約 17 μm，長50～70 μm，可見網狀紋理薄壁細胞，類圓形、類長方形或不規則形，寬約 40 μm，長約83 μm；⑨下表皮細胞碎片常見，寬 25～30 μm 長60～67 μm，紋孔明顯；⑩可見較多纖維束，內含類圓形硅質塊，硅質塊大小約 6～10 μm；非腺毛為單細胞，稍彎曲，長約22 μm，寬約4 μm。見圖 5。

注：1.氣孔；2.石細胞；3.木纖維；4.淀粉粒；5.草酸鈣簇晶和方晶；6.針晶及針晶束；7.導管；8.薄壁細胞；9.表皮細胞；10.纖維及硅質塊；11.非腺毛。

2.2 總氨基酸含量測定

有研究表明，蘭科植物中主要含有菲類、聯芐、甾體、黃酮類、多糖、氨基酸等成分[6]。目前對蘭科植物中總氨基酸含量測定的研究報道很少，采用溶劑加熱回流提取法提取總氨基酸，并參照《中國藥典》2020版中紫外可見分光光度法[7]，以甘氨酸為對照品、用茚三酮顯色法測定細葉石仙桃中的總氨基酸含量。

2.2.1 溶液的制備 準確稱取甘氨酸對照品0.5 000 g，用蒸餾水至完全溶解并定容100 mL，得甘氨酸標準貯備液。精密移取甘氨酸標準貯備液1.0 mL于100 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度，得 0.05 mg/mL甘氨酸標準使用液；精密稱取茚三酮1.000 g，加入適量的無水乙醇至完全溶解后，定容至50 mL，得2%茚三酮溶液，冷藏備用；取一定量醋酸鈉加蒸餾水溶解，用冰醋酸溶液緩慢調節pH，加蒸餾水稀釋定容至100 mL，搖勻，即得醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH=6)標記備用；準確稱取細葉石仙桃樣品約1.5 g，置于圓底燒瓶中，加入85%的乙醇35 mL，于90 ℃水浴鍋中加熱回流60 min，將提取液抽濾，濾渣重復1次，合并濾液，將濾液移至100 mL容量瓶，用85%乙醇定容至刻度，搖勻，得供試品溶液。

2.2.2 檢測波長的選擇 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各2 mL，置于10 mL容量瓶中，隨行空白，再分別加入2%茚三酮溶液3.0 mL和醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH=6)2.0 mL，混勻，置于90 ℃水浴中加熱15 min，待冷卻至室溫，用蒸餾水定容，在190～900 nm區間掃描。結果表明：陰性空白溶液無干擾，說明顯色方法的專屬性良好，供試品與對照品溶液在568 nm 均有最大吸收，故選擇測定波長為568 nm。

2.2.3 檢測條件的單因素考察 本實驗前期預實驗對顯色劑用量、緩沖溶液pH、緩沖液用量、水浴加熱溫度、水浴加熱時間進行了檢測條件的考察。結果表明：最佳檢測條件為測定波長568 nm、2%茚三酮溶液用量3.0 mL、緩沖液pH=6、緩沖液用量2.0 mL、水浴加熱溫度80 ℃、水浴加熱時間40 min。

2.2.4 提取工藝的單因素試驗考察 本實驗前期預實驗對乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數進行單因素考察，并在單因素實驗的基礎上，對4個考察因素進行四因素三水平正交試驗，已優選出最佳提取條件為85%乙醇，35.0 mL乙醇，提取60 min，提取2次。

2.2.5 線性關系的考察 分別精密吸取甘氨酸對照品溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、12.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加水定容，按“2.2.2”項下操作方法，測定其吸光度值。以甘氨酸對照品溶液的濃度C(μg/mL)為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：A= 0.059C+ 0.083，R2= 0.999 1。

2.2.6 方法學考察 按文獻[4]、[5]方法和在本課題組前期實驗的基礎上，分別進行精密度試驗、重復性試驗、穩定性試驗及加樣回收率試驗，結果供試品溶液吸光度的RSD小于3%，表明儀器精密度、試驗重復性良好；供試溶液在6 h內穩定；其加樣回收率為96.84%～101.21%。

2.2.7 含量的測定 取8批細葉石仙桃藥材，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液和顯色后，分別測定吸光度，計算總氨基酸的含量。結果表明，8批藥材中的總氨基酸含量為4.290～6.310 mg/g，即為0.429%～0.631%。考慮到不同地方收集的藥材樣品含量差異，以及實驗操作過程中可能存在的誤差性，因此暫定閩產細葉石仙桃按干燥品計算，以甘氨酸(C2H5NO2)計其總氨基酸含量，不得少于0.4%。

3 討論

本文通過性狀和顯微鑒別，特征結果與趙秀貞[8]、張小佳等[9]的研究有所差異。細葉石仙桃顯微特征明顯，須根含較多簇晶，內皮層通道細胞單個存在；根莖外韌型維管束 110 個，韌皮部一側具有新月形纖維束，纖維外側有硅質塊；假鱗莖表皮細胞一列，壁全增厚，未見角質層，基本組織細胞以紋孔狀紋理居多，有淀粉粒和簇晶，外韌型維管束65 個，韌皮部一側具纖維束，纖維外側具硅質塊和空腔；尤其葉的維管束以主脈處較小，一對側脈明顯偏大，上下表皮均具有內凹的非腺毛等特征，均可作為細葉石仙桃的鑒別特征。但其中假鱗莖整體橫切面整體性狀與原植物有所差異，初步推測因為未及時切片等原因造成。

參閱所查文獻可知，測定氨基酸的方法有很多種。在預實驗在基礎上，對比幾種測定方法，考慮到紫外分光光度法操作簡便、快速，靈敏度高，實驗成本低。故本文采用紫外分光光度法來初步測定不同產地細葉石仙桃中的總氨基酸。

研究結果明確了細葉石仙桃的基源及顯微特征，可作為其品種鑒定的重要依據。同時暫定了細葉石仙桃藥材中總氨基酸含量不得少于0.4%，可為細葉石仙桃的進一步研究、質量控制和資源開發利用提供參考。