當歸補血膏制備工藝研究

仰 蓮，黃 宇，姜艷嬌，錢江平，孫紀元，胡昌江，李 恒

(四川新綠色藥業科技發展有限公司/國家中醫藥管理局“中藥配方顆粒質量與療效評價”重點研究室，四川 成都 611900)

當歸補血湯由黃芪、當歸組成，起源于金元時期李東垣《內外傷辨惑論》，為治療氣血兩虛證的經典名方，臨床主要用于治療疲勞、內傷、氣血虛弱、婦女月經、產后血虛熱、頭痛、潰瘍等?，F代研究表明，當歸補血湯在免疫調節及抗疲勞等方面具有顯著的臨床療效，常用于癌癥放化療的輔助治療，以及血虛、產后康復及抗疲勞等[1-4]。免疫力低下癥主要表現為體質虛弱、營養不良、精神萎靡、疲乏無力、食欲降低、睡眠障礙等。當歸補血湯的主要功效為補氣生血，因此，當歸補血湯作為基礎補益方，常用于治療體質虛弱、睡眠障礙、全身無力等癥，對于食少納差、營養不良等癥，該方在應用上存在一定不足。

當歸補血膏是在當歸補血湯的基礎上加枸杞、大棗、陳皮配伍而來，是著名川派炮制傳承人胡昌江教授的臨床常用經驗方，通過黃芪與當歸兩者合用陽生陰長，氣旺生血；同時，再輔以枸杞補益肝腎，大棗補中益氣、養血安神，陳皮理氣健脾；全方合用共奏滋補肝腎、健脾理氣、益衛固表、扶正固本之效，從而增強機體免疫機能，主要適用于工作壓力大、過度疲勞、產后氣血不足、癌癥放化療后免疫功能低下的人群。

膏方又叫煎膏劑、膏滋，以其劑型為名，屬中醫傳統的丸、散、膏、丹、酒、露、湯、錠八種劑型之一。膏方的傳統制備工藝為中藥飲片加水煎煮，取煎煮液濃縮，加煉蜜、糖、阿膠、龜甲膠、鹿角膠等制成半流體制劑[5]。傳統膏方處方藥味多，結合每個人的體質、臨床表現，常為醫院或診所開具的單人單方，膏方制備需要具備相關資質的人員操作，才能確保膏方的質量，保障膏方的療效。然而，單人單方的膏方制作工藝沒有統一的標準，膏方制作的設備、人員操作水平、管理水平、質量標準等都存在較大的差異，因此中醫膏方的成品質量存在較大差異[6]。當歸補血湯處方短小精妙，配伍合理，將此方開發為膏方，在傳統的以水煎煮、提取、熬制的基礎上，以無糖型輔料為基礎，建立統一的制備工藝和質量標準，可食用人群廣泛，為膏方的傳承、推廣、創新提供了新的思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20 AD型高效液相色譜儀(日本島津公司)；Agilent 1260 型高效液相色譜儀，蒸發光散射檢測器，Agilent ChemStation色譜工作站(美國 Agilent 公司)；ME204E 型電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；XPE26 型電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；KQ-2005DB 型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；GZX-9023 型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海博迅醫療生物儀器股份有限公司)；水浴鍋等。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111920-201606，含量以 97.6% 計)；黃芪甲苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110781-201717，含量以 96.9% 計)；水為純化水，其他試劑均為色譜純。

1.3 藥材

當歸補血膏組方中的黃芪、當歸、大棗、枸杞等中藥材由四川新綠色藥業科技發展有限公司提供，經公司質量部檢驗合格后，由藥廠前處理車間炮制而來。

2 方法與結果

2.1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 ZORBX Eclipse Plus C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈為流動相 A，以 0.2% 甲酸溶液為流動相 B，采用梯度洗脫：0～20 min，20%～40% A，80%～60% B；20～30 min，40% A，60% B；檢測波長260 nm，流速1.0 mL/min，進樣量 10 μL，柱溫 30 ℃。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇 50 mL 制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品約 2 g，精密稱定，置于具篩錐形瓶中，加入甲醇50 mL，精密稱定，超聲處理30 min，放冷，以甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 專屬性試驗 稱取1倍處方量的飲片(缺黃芪)，加水 400 mL 煎煮提取1 h，過濾，取續濾液，即得缺黃芪的陰性溶液。分別吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件測定。對照品與供試品溶液在相同的位置上有對應的色譜峰，陰性對照溶液在對應的位置上無干擾。專屬性實驗結果，見圖1。

圖1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷專屬性實驗結果

2.1.5 儀器精密度試驗 精密吸取濃度為 50.537 28 μg/mL的對照品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件連續進樣 6 次，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積。結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為 0.10%，實驗結果表明儀器精密度良好，符合含量測定的要求。

2.1.6 線性關系考察 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，加甲醇制成濃度為 0.1 mg/mL的母液，分別精密吸取上述母液 2.5、2.5、5、2.5、2.5 mL置于 5、10、25、25、50 mL 容量瓶中，以甲醇稀釋定容至刻度線即得濃度為100、50、25、20、10、5 μg/mL的系列對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定峰面積，以進樣量(X，ng)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標繪制響應曲線，得線性回歸方程Y=3 260.188 5X+8 474.395 8，r=0.999 8。表明進樣量在54～1 089 ng時，呈良好的線性關系。

2.1.7 溶液穩定性考察 取同一批樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h，按照“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積。毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為 0.36%，結果顯示供試品溶液制備后24 h 內測定基本穩定，符合含量測定要求。

2.1.8 重復性考察 取同一批樣品，按“2.1.3”項下方法平行制備 6 份供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件測定，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積。計算 6 份樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均含量為0.358 mg/g，RSD為 0.93%，表明供試品溶液的制備方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品6份，各1 g，置于 150 mL 具篩錐形瓶中，精密加入 50 mL 濃度為 3.9820 8 μg/mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液，按照“2.1.3”項下方法制備成供試品溶液(1∶1)。按照“2.1.1”項下色譜條件測定，計算其加樣回收率。結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率為 105.23%，RSD為2.57%。表明該方法的準確度較高。

2.2 黃芪甲苷含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 Agilent 5 TC-C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈-水(32∶68)為流動相；蒸發光散射檢測器檢測；流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，柱溫 30 ℃。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇50 mL 制成每1 mL 含50 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品約 2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 4% 濃氨試液的 80% 甲醇溶液 100 mL，稱定重量，超聲處理60 min，超聲時振搖 1～2 min，使完全分散，超聲完放冷，再稱定重量，以 4% 濃氨試液的 80% 甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，過濾。精密量取續濾液 25 mL，蒸干，殘渣用 80% 甲醇溶解，轉移至 5 mL量瓶中，加 80% 甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 專屬性試驗 稱取 1 倍處方量的飲片(缺黃芪)，加水 400 mL 煎煮提取1 h，過濾，取續濾液，即得缺黃芪的陰性溶液。分別吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件測定。對照品與供試品溶液在相同的位置上有對應的色譜峰，陰性對照溶液在對應的位置上無干擾，結果見圖2。

注：A：溶劑空白；B：供試品溶液；C：陰性溶液；D：黃芪甲苷。

2.2.5 儀器精密度試驗 精密吸取濃度為0.490 7 mg/mL的對照品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件連續進樣 6 次，記錄黃芪甲苷的峰面積。結果黃芪甲苷峰面積的RSD為 2.08%，實驗結果表明儀器精密度良好，符合含量測定的要求。

2.2.6 線性關系考察 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成濃度為 1.0 mg/mL 的母液，分別精密吸取上述母液 2.5、1.25、0.5、0.5、0.25 mL 分別置于 5、5、5、10、10 mL 容量瓶中，以甲醇稀釋定容至刻度線，即得濃度為 1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025 mg/mL 的系列對照品溶液。按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積，進樣 10 μL，以進樣量(X，ng)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標繪制響應曲線。得線性回歸方程Y=1.725 3X+1.525 0，r=0.999 6。表明黃芪甲甘進樣量在 0.25～10 μg時，呈良好的線性關系。

2.2.7 溶液穩定性考察 取同一批樣品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后 0、2、4、6、8、12、24 h，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄黃芪甲苷的峰面積。黃芪甲苷的峰面積的RSD為 3.87%，結果顯示供試品溶液制備后 24 h 內測定基本穩定，符合含量測定要求。

2.2.8 重復性考察 取同一批樣品，按“2.2.3”項下方法平行制備 6 份供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄黃芪甲苷峰面積。計算 6 份供試品中黃芪甲苷含量的RSD為 3.37%，表明該方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知黃芪甲苷含量的供試品約 1 g，共 6 份，精密稱定，分別加入濃度為8.651 232 μg/mL 的黃芪甲苷對照品溶液100 mL，照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件測定，計算黃芪甲苷的加樣回收率。結果黃芪甲苷的平均回收率為 105.9%，RSD為 1.47%，表明該方法的加樣回收率符合要求。

2.3 正交優選提取工藝試驗

本實驗研究采用正交設計L9(34)進行正交試驗，以加水量(A)、提取時間(B)、煎煮次數(C)為影響因素，以黃芪甲苷溶出量(mg/g)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷溶出量(mg/g)、出膏率三個指標進行評價，對當歸補血膏的提取工藝進行優化。水提正交試驗設計和結果，見表1、表2。

表1 水提工藝正交試驗設計與結果

表2 水提工藝方差分析結果

2.3.1 結果分析 對出膏率、指標成分溶出量進行綜合加權評分。分別賦值出膏率 50%，黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的溶出量為 25%，無綱量化計算以出膏率為例，計算公式如下：無綱量化計算公式：Xn=Xi/Xmax×100%(注：Xi為每個正交試驗的出膏率結果；Xmax為正交試驗的出膏率最大值；綜合評價值=Xn(出膏率)×50%+Xn(黃芪甲苷)×25%+Xn(毛蕊異黃酮葡萄糖苷)×25%)。表2、表3的綜合評價結果顯示，影響提取的 3 因素中，具有統計學意義(*P<0.05)的是提取次數，其次為加水倍數，最后為提取時間，最佳的提取工藝為 A3B3C3。對于提取時間而言，3個水平的提取時間對于出膏率、成分的溶出量并沒有顯著影響，結合大生產以節約能源和優化提取率為主，優選最佳提取工藝為A3B2C3?？紤]大生產經濟節能的要求，工藝驗證階段同時驗證提取2次、提取3次，對于指標成分溶出量和出膏率的影響，以進一步優化最佳提取工藝。

2.3.2 提取工藝驗證 以“2.3.1”項中初步擬定的煎煮倍數 12 倍、煎煮時間 60 min 為條件，同時考察煎煮 2 次和煎煮 3 次的影響，并以此進行驗證。測定出膏率(%)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷的溶出量(mg/g)，見表 3。結果表明，對于出膏率和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的溶出量，2 次煎煮的溶出量約占 3 次煎煮溶出量的 95% 以上；而對于黃芪甲苷的溶出量，2 次煎煮的溶出量約占 3 次煎煮溶出量的 72% 以上，結合工業化大生產考慮經濟節能的角度，煎煮2次基本能夠較大程度地提取出處方藥味中主要有效成分。因此，綜合以上分析，優選的最佳提取工藝為加水12倍、提取2次、每次1 h。

表 3 水提工藝驗證結果 (n=6)

2.4 濃縮工藝研究

減壓濃縮具有濃縮時間短、濃縮溫度低，能防止和減少熱敏性物質的分解，提高有效成分保留率等特點。因此，結合處方中藥材的性質，本實驗選擇減壓濃縮工藝，以單因素試驗，分別對濃度溫度(60 ℃、70 ℃、80 ℃)和濃縮壓力(-0.07 MPa、-0.08 MPa、-0.09 MPa)進行考察，以浸膏量(g/L)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷轉移率(%)為指標，對濃縮工藝參數進行了研究，見表4。結果表明，溫度在 60～80 ℃、壓力在-0.07～-0.09 MPa，對浸膏量、黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率無顯著影響。因此，確定最佳濃縮工藝為：溫度60～80 ℃，壓力-0.07～-0.09 MPa。

表4 濃縮工藝考察結果

2.5 膏方制劑工藝研究

膏方按是否選用動物膠(阿膠、龜板膠、鹿角膠、黃明膠等)加工收膏分為葷膏和素膏，按是否加糖類(如蜂蜜、冰糖、白糖、紅糖、飴糖等)收膏分為糖膏(或蜜膏)和清膏[7]。現代無糖型輔料和甜味劑如木糖醇、麥芽糖醇液、甘露醇、麥芽糖醇、β環糊精、麥芽糊精、三氯蔗糖、甜菊糖苷、紐甜等的開發利用，為無糖型膏方的制備提供了更多選擇。

制劑工藝采用傳統膏方煎煮、濃縮、熬膏、收膏、涼膏的工藝路線，以無糖型處方為出發點，對膏方的輔料種類和比例，甜味劑(也叫矯味劑、掩味劑)的輔料種類和比例進行了考察。

2.5.1 輔料種類考察 選用麥芽糖醇液、木糖醇、甘露醇為輔料，分別以清膏(清膏相對密度為 1.2，清膏的出膏比率約為 84%)-輔料比 100∶70 加入，研究不同輔料加入后膏滋的口感，篩選出最佳輔料，同時觀察是否有不溶物，結果見表5。結果表明，甜度順序為：麥芽糖醇液>木糖醇>甘露醇；苦味度順序為：麥芽糖醇液>木糖醇；麻舌感順序為：麥芽糖醇液>木糖醇；溶液顏色深度順序為：木糖醇>麥芽糖醇，溶液澄清透明，均無不溶物。綜合以上初篩結果，優選木糖醇為當歸補血膏的輔料，進一步對輔料比例進行篩選。

表5 不同輔料考察結果

2.5.2 輔料比例考察 以甜味劑輔料篩選結果為參考，對木糖醇的加入比例進行考察?？诟薪Y果，見表 6。結果表明：清膏與木糖醇比例為 100∶70 時制成的膏劑口感適宜，但經過樣品放置觀察，清膏-輔料比為 100∶70 和 100∶50 時制備的膏，放置5～10 d后，會反砂，而飲片-輔料比為 100∶30 制備的膏放置較長時間都沒有出現反砂。故木糖醇的比例不能超過清膏的 30%，但木糖醇比例降低后會有明顯的酸澀感、麻舌感和苦味。

表6 木糖醇加入比例考察結果

2.5.3 掩味劑種類及比例考察 根據“2.5.2”輔料比例考察結果及口感評測，清膏-輔料(木糖醇)比為100∶30 制成的膏方味苦、麻舌，有酸澀感。因此考慮以β-環糊精和γ-環糊精等進行攪拌包合，以改善不良口感，結果見表 7、表 8。結果表明，β-環糊精能較好地掩蓋處方不良口感，并且以 2.0% 的比例加入效果最好。

表7 包合物種類考察結果

表 8 β-環糊精加入比例考察結果

3 討論

3.1 提取濃縮工藝

本方提取工藝為傳統的水煎提取，采用正交設計法，以加水量、煎煮時間和煎煮次數為因素，以黃芪甲苷的溶出量、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的溶出量、出膏率為考察指標，同時結合大生產的經濟節能，對提取工藝進行篩選，并進行工藝驗證。優選了處方的最佳提取工藝為：加水量 12 倍、提取時間 1 d、煎煮次數為 2 次。濃縮工藝考察采用減壓濃縮的方式，分別考察濃縮溫度和壓力對指標成分、出膏率的影響，確定處方的最佳濃縮工藝為溫度60～80 ℃，壓力-0.07～-0.09 MPa。

3.2 制劑制備工藝

處方制劑工藝在保持傳統的煎煮、濃縮、熬膏、收膏、涼膏的工藝路線下，采用無糖型處方對傳統膏方進行創新，確定輔料用量比例，以期應用于工業化大生產。輔料加入比方面，傳統膏方處方量大，輔料用量通常為飲片用量的1/5或清膏用量的1～2倍[8]。本方處方藥味少，出膏率(干膏率)約為40%～50%，出膏率較大，方中當歸、枸杞、大棗、黃芪均含多糖類物質[9-12]，多糖黏性較大，使得清膏較為黏稠，較少的輔料進行膏方的制備即可成型，一定程度上加大了藥物的載藥量，降低了日服用劑量，增大了患者的順應性。本方工藝短小精妙，通過工業化大生產，能有效保障產品質量的穩定性、均一性，同時能擴大產品的適用人群。