基于網絡藥理學的葉下珠作用機制分析

潘新波，薩日娜，趙麗娟，張 偉，李彩東*

(1.蘭州市第二人民醫院，甘肅 蘭州 730046；2.北京中醫藥大學，北京 100029；3.甘肅省人民醫院，甘肅 蘭州 730000)

葉下珠(PhyllanthusurinariaL.)為大戟科葉下珠屬植物, 藥用全草，是我國傳統中草藥。有平肝清熱、利水解毒之功效，民間多用來治療小兒疳積、腸炎、尿路感染和黃疸肝炎等病癥[1]。近年來，國內外學者對葉下珠的基礎研究主要集中在化學成分、藥理作用及機制，臨床研究主要集中在抗乙肝病毒、抗肝細胞纖維化、改善肝功能及抗腫瘤等方面[2,3]，有關其抗腫瘤、抗血栓及抗氧化等作用的研究發現，葉下珠化學成分豐富，藥理作用顯著[4,5]，是一種值得深入開發的天然藥物[6]。本研究采用網絡藥理學的方法，借助化合物、蛋白、疾病以及生物信息注釋等多個數據庫，構建葉下珠化合物-靶點-信號通路-疾病的網絡預測模型，從分子水平預測并探討葉下珠的藥理作用機制，為更有針對性地深入開展葉下珠的實驗研究及臨床合理應用提供參考。

1 資料與方法

1.1 化合物的收集

以“葉下珠”“PhyllanthusurinariaL.”“Phyllanthusurinaria”或“PhyllanthusurinariaLinn.”為關鍵詞檢索中國知網(https://www.cnki.net/)、萬方數據庫(www.wanfangdata.com.cn)、PubMed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、Springer(https://link.springer.com/)、Elsevier(https://www.elsevier.com/en-xs)、Wiley Online Library(https://onlinelibrary.wiley.com/)和Taylor & Francis Online(https://www.tandfonline.com/)等中英文引文數據庫，并對中國天然產物化學成分數據庫(http://www.pharmdata.ac.cn/cnpconline/)、臺灣中醫藥資料庫(http://tcm.cmu.edu.tw/)、TCMSP(http://tcmspw.com/)、TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)和BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)數據庫進行查詢，檢索日期截止至2020年9月30日，收集葉下珠中所含化合物。

1.2 化合物篩選

根據藥物的吸收、分布、代謝、排泄(ADME)相關特性，以Lipinski五規則作為評估類藥性的重要指標[7-8]，另結合文獻對未納入篩選標準但已有報道葉下珠中具有生物活性和藥理作用的化合物進行收集。將化合物信息在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索，獲得相應的SMILES結構式。

1.3 化學物靶點預測及化合物-靶點通絡網絡構建

將收集的葉下珠中化合物SMILES結構式，分別采用TCMSP、TCMID、CHEMBL(https://www.ebi.ac.uk/chembl/)、SWISS(http://www.swisstargetprediction.ch/)(probability≥0.7)、STICH(http://stitch.embl.de/)(score≥0.7)在線靶標預測平臺進行檢索[9]，預測靶標蛋白，在NCBI和Uniprot數據庫中標準化基因名，采用Cytoscape 3.7.2軟件構建葉下珠化合物-靶點網絡圖。

1.4 網絡構建與靶標分析

通過STRING(https://string-db.org/)構建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡，蛋白種屬設置為“Homosapiens”，最低相互作用閾值設為中等“medium confidence”(0.4)，其他參數采用默認設置。采用Cytoscape 3.7.2中CytoNCA插件進行拓撲屬性分析，以度中心性(DC)、介度中心性(BC)、接近中心性(CC)、特征向量中心性(EC)、網絡中心性(NC)和局部邊連通性(LAC)為指標，在PPI網絡中，篩選DC≥2倍中位數，BC、CC、EC、NC、LAC分別≥1倍中位數的靶點，作為葉下珠發揮治療作用的候選靶點，并構建候選靶點與對應化學成分網絡圖，利用Cytohubba插件獲取degree值分別前10的Hub靶點和葉下珠發揮作用的關鍵成分[10]。

1.5 預測候選靶點與疾病分析及網絡構建

在TCMSP、DisGenet(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/search)、DrugBan(https://www.drugbank.ca/)、OMIM(https://omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、CTD(http://ctdbase.org/)和PubMed中收集葉下珠候選靶點對應的疾病，將候選靶標蛋白和對應疾病構建候選靶點-疾病網絡，選取degree值≥2倍中位數的對應疾病并進行分析。

1.6 靶標通路富集分析

利用DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)輸入所篩選的葉下珠10個Hub靶點，設定閾值P<0.01，進行基因本體(GO)富集分析和基因功能(KEGG)通路富集分析，通過Omicshare Tools 3.0在線繪圖網站(http://www.omicshare.com/)對結果進行可視化處理。

1.7 化合物-靶點-信號通路-疾病網絡構建

將所篩選葉下珠degree值前10的關鍵成分及Hub蛋白、“1.6”項下富集篩選后的KEGG信號通路及“1.5”項下篩選后的疾病，采用Cytoscape 3.7.2軟件中Merge功能構建葉下珠關鍵成分-關鍵靶點-信號通路-疾病網絡，進一步分析探討葉下珠化合物、靶點和信號通路在治療相關疾病的作用機制。

2 結果

2.1 化合物收集及篩選

截止2020年9月30日，共檢索出相關文獻502篇，結合數據庫查詢，收集葉下珠中356個化合物。以Lipinski五規則作為篩選標準，結合文獻共納入205個化合物，在PubChem數據庫獲得相應的SMILES結構式。

2.2 靶點獲取、化合物-靶點網絡及PPI網絡構建

將收集的205個化合物采用TCMSP、TCMID、CHEMBL、SWISS、STICH在線靶標預測平臺檢索，共有154個化合物匹配到651個靶標蛋白，在Uniprot中標準化基因名，構建化合物-靶點網絡，見圖1-A，另將651個靶點通過STRING構建PPI網絡，見圖1-B。采用Cytoscape 3.7.2中CytoNCA插件分析所得PPI網絡，按照“1.4”項下指標篩選，共得到36個候選靶點，對應葉下珠中82個化合物，具體信息見表1，圖2為36個候選靶點PPI網絡圖。以候選靶點與對應化學成分構建網絡圖，見圖3-A。以degree值篩選度值前10的Hub蛋白，依次為PTGS2，HSP90AA1，CASP3，ESR1，TNF，AKT1，MMP9，JUN，MTOR，PPARG，葉下珠發揮作用的關鍵成分按度值大小依次為Pu31、Pu1、Pu40、Pu39、Pu6、Pu139、Pu30、Pu10、Pu8和Pu11，即(-)-Epigallocatechin gallate(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)、quercetin(槲皮素)、Luteolin(木犀草素)、Fisetin(非瑟酮)、ellagic acid(鞣花酸)、Eupatilin(異澤蘭黃素)、(-)-Epicatechin(表兒茶素)、rutin(蕓香苷)、kaempferol(山柰酚)、Corilagin(柯里拉京)。

注：A.154個化合物-651個靶點網絡圖；B.651個靶點PPI網絡。

圖2 葉下珠中36個候選靶點PPI網絡

注：A.36個候選靶點-82個化合物網絡圖；B.degree值篩選前10的關鍵靶點與關鍵成分網絡圖。

表1 葉下珠中候選化合物信息

2.3 預測候選靶點與疾病、疾病靶點的篩選

將36個候選靶點分別在TCMSP、DisGenet、DrugBank、OMIM、TTD、CTD和PubMed數據庫中檢索，獲得葉下珠36個候選靶點匹配的疾病299種，構建靶點-疾病網絡Ⅰ，見圖4。為更為直觀探討分析葉下珠治療疾病的機制，本研究對其10個關鍵Hub靶標蛋白對應的227種疾病構建關鍵靶點-對應疾病網絡Ⅱ，見圖5，以degree值≥2倍中位數(n=1)，即degree≥2為篩選條件，收集葉下珠發揮治療作用的候選疾病97種，與相應的靶點蛋白重新構建靶點-疾病網絡Ⅲ，見圖6。

注：節點的大小與節點的度值呈正比例關系。

注：節點的大小與節點的度值呈正比例關系。

2.4 靶標通路富集分析

DAVID數據庫中GO功能富集分析結果見圖7，以P<0.01為篩選條件，得到GO條目37個，其中BP(生物過程)條目29個、CC(細胞組分)條目2個、MF(分子功能)條目6個，分別占78.4%、5.4%、16.2%，其納入條目主要分為基因表達、轉錄翻譯、增殖凋亡、糖皮質激素、雌激素、含氮物質代謝及代謝調控等方面。

圖7 葉下珠10個關鍵靶點的GO分析

KEGG Pathways分析篩選得到24條通路(P<0.01)，以疾病相關程度和P值進行篩選，其中基因數目≥4的通路有9條，見圖8，主要涉及癌癥信號通路(Pathways in cancer)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、癌癥蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、雌激素(Estrogen signaling pathway)、乙肝(Hepatitis B)等信號通路。

注：Rich factor值越大，表明通路富集程度越高；點的大小表示富集到的靶點數量。

2.5 關鍵成分-關鍵靶點-信號通路-疾病網絡構建

所構建的葉下珠關鍵成分-靶點-信號通路-疾病網絡，見圖9。葉下珠以(-)-Epigallocatechin gallate、quercetin、Luteolin、Fisetin、ellagic acid、Eupatilin、(-)-Epicatechin、rutin、kaempferol和Corilagin為關鍵成分，作用于PTGS2、TNF等10個關鍵靶標蛋白，主要通過調控Pathways in cancer、TNF signaling pathway、Proteoglycans in cancer和Estrogen signaling pathway等信號通路，發揮治療Colonic Neoplasms、Inflammation、Adenocarcinoma、Liver Neoplasms等17種不同疾病的作用。結合相關文獻，通過圖9分析結果，本文預測了葉下珠中特征性成分發揮治療疾病的作用機制，結果見表2。結果顯示，Corilagin、(-)-Epicatechin和(-)-Epigallocatechin gallate主要通過PTGS2、TNF和HSP90AA1靶點，調控Pathways in cancer、TNF signaling pathway及T cell receptor signaling pathway和Toll-like receptor signaling pathway信號通路，治療結腸腫瘤、腺癌、前列腺腫瘤、膀胱腫瘤、肝腫瘤和乳腺癌及炎癥的作用，ellagic acid通過AKT1、MMP9靶點，調控Prostate cancer、Toll-like receptor signaling pathway、T cell receptor signaling pathway及Pathways in cancer信號通路，發揮治療前列腺腫瘤、膀胱癌、結腸腫瘤及炎癥的作用；此外，Corilagin、(-)-Epigallocatechin gallate可能通過TNF靶點，調控MAPK signaling pathway信號通路，治療心肌梗死、動脈粥樣硬化和腦缺血，且上述三種化合物還可通過TNF靶點，調控TNF signaling pathway信號通路，治療再灌注損傷。其他非特征性成分Fisetin、Luteolin、quercetin、rutin和kaempferol可通過作用于TNF、PTGS2、AKT1及MMP9，發揮抗炎、抗癌作用。Fisetin、quercetin、Luteolin、kaempferol、rutin及Eupatilin可作用于TNF、CASP3和JUN，發揮抗氧化、抗血栓的作用，可治療心肌梗死、動脈粥樣硬化、腦損傷和阿爾茲海默病等。Quercetin、kaempferol、Luteolin和Eupatilin可作用于PPARG，治療結腸腫瘤、Ⅱ型糖尿病、腺癌、肝腫瘤、動脈粥樣硬化和阿爾茲海默病等。

表2 葉下珠主要藥理作用機制分析

注：波浪線箭頭代表近幾年葉下珠特征性成分新的藥理作用機制預測；虛線箭頭代表葉下珠特征性成分主要藥理作用機制預測；三角形代表特征性化合物；菱形代表degree值前5的信號通路；倒三角箭頭代表所主要治療疾病；節點的大小與節點的度值呈正比例關系。

3 討論

葉下珠具有利水解毒、平肝清熱功效，作為利尿劑和解毒劑在全球亞熱帶區域國家均有使用。近年來，國內外學者對葉下珠在抗乙型肝炎病毒、保肝護肝、抗腫瘤、抗病原微生物、抗氧化、抗血栓等藥理作用研究方面均取得一定進展[11-12]。由于該藥物資源豐富，提取物低毒性[13]，未見不良反應報道，故應用開發前景廣闊。

本研究通過數據庫檢索，運用網絡藥理學構建了葉下珠活性成分-靶點-信號通路-疾病網絡，系統預測了葉下珠發揮藥理作用的關鍵物質基礎，即10種化合物，10個潛在關鍵作用靶點，24條信號通路和17種疾病。既往研究表明，表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過影響多條信號轉導通路中的多個靶分子，抑制腫瘤血管新生和腫瘤轉移，具有細胞周期抑制和促凋亡作用[14]。槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗炎、抗癌防癌、抗菌、抗病毒及預防和治療心血管疾病等多種生物活性及藥理作用[15-17]。木犀草素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗過敏、抗纖維化、抗糖尿病、神經保護和心臟保護等多種藥理作用[18-20]。非瑟酮具有對抗不同病理過程的作用，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降糖、神經保護、抗動脈粥樣硬化等[21-22]。鞣花酸作為一種天然多酚類生物活性物質，具有清除自由基、抗腫瘤、抗炎、抗病毒效能等多種藥理作用[23-24]。異澤蘭黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種顯著的藥理活性[25]，其抗炎和細胞保護活性較強，現已開發出保護消化道黏膜的胃腸道用藥，對多種癌細胞有抑制作用，并對化療藥物有減毒效果[26]。國外研究顯示表兒茶素能明顯減緩氧化，預防癌癥，減輕炎癥，延遲或治療人和動物中由衰老和神經引起等相關病癥[27-28]。蕓香苷具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗肥胖、抗癌、神經保護、血管保護及心臟保護等多種藥理學活性，在消化系統疾病的炎癥過程中具有明顯的調節作用[29-30]。現代藥理研究發現，山柰酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、保護神經、肝臟和心肌、防治糖尿病和骨質疏松等藥理活性[31-33]，已在臨床上用于治療胃癌及心腦血管疾病[34]。柯里拉京具有抗腫瘤、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗纖溶、降血壓、抑制病毒、抗菌、抗炎等廣泛的藥理活性[35-36]。因此推測葉下珠治療結腸腫瘤、腺癌、前列腺腫瘤、膀胱腫瘤、肝腫瘤和乳腺癌及炎癥的機制可能與TNF、AKT1、PTGS2和MMP9靶點有關，治療心肌梗死、動脈粥樣硬化和腦缺血的機制可能與靶點TNF、CASP3有關。

本研究運用網絡藥理學技術，對葉下珠中的多組分、多靶點及疾病之間的關系和作用機制進行了較為系統的預測分析，通過對所篩選出的以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、鞣花酸、柯里拉京為代表的10個關鍵化合物進行了靶點、疾病及信號通路分析，與所檢索文獻[11-14, 37]針對葉下珠近年來藥理學研究分析結果所顯示葉下珠具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抗血栓等主要藥理作用較為一致，且表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、鞣花酸、表兒茶素和柯里拉京均為多酚類成分，也是近年來對葉下珠化學成分分析研究的特征性成分。除此之外，本研究具有的一些特色體現在構建了其關鍵核心靶點所對應核心化合物及信號通路和疾病的多層次網絡模型圖，并結合當前相關文獻研究結果進行印證，為進一步明確葉下珠的藥理作用機制提供了研究參考。

本研究結論尚存在一定的局限性，由于各數據庫檢索數據和文本挖掘獲取化合物及靶點數量有限，且槲皮素、蕓香苷及山柰酚在自然界植物中大量存在，靶點、信號通路及疾病數據存在對這幾種物質篩選有一定的傾向性，采用相應分析軟件的分析算法僅評價節點相互關系，未考慮各候選成分含量、化合物間相互作用及藥物體內代謝過程等因素，預測結果可能存在偏差，還需進一步體內體外的藥理和臨床試驗驗證。