基于網絡藥理學和分子對接探討蒙藥額爾敦-烏日勒治療癲癇的潛在作用機制

于 凱，卜 凡，李 鵬，蘇 秦，夏 蕾，薛金曄，郝 雷

(1.內蒙古醫科大學 第一臨床醫學院，內蒙古 呼和浩特 010050；2.內蒙古醫科大學附屬醫院 兒科，內蒙古 呼和浩特 010050；3.內蒙古醫科大學 內蒙古臨床醫學院，內蒙古 呼和浩特 010110；4.內蒙古醫科大學 基礎醫學院病理生理學教研室，內蒙古 呼和浩特 010110)

據WHO統計，全球癲癇患者超過5 000萬，而癲癇患者中有超過八成分布在發展中國家，其中我國癲癇患者超過600萬，每年還有40萬左右的新發癲癇患者，我國癲癇患病率為4‰～7‰，年發病率在3左右[1]。目前，抗癲癇藥物治療為目前臨床最主要的治療方案，對于癲癇短期臨床發作，60%～70%的患者可以實現無癲癇癥狀發作[2]，但對于癲癇的長期治療尚無滿意治療方案[3]。

藥物額爾敦-烏日勒，也稱額爾敦-烏日勒，是蒙藥中治療和預防神經和精神系統疾病的常用藥物，具有神經保護及神經再生作用[4-5]。據研究表明此藥不僅能抑制癲癇的發生和發作程度，還能減輕癲癇發作后的認知及情緒方面的并發癥[6]。但迄今為止，額爾敦-烏日勒治療癲癇的作用靶點及潛在作用機制尚不明確。本研究將基于網絡藥理學和分子對接技術探討額爾敦-烏日勒治療癲癇的作用靶點及潛在作用機制，現將研究情況報道如下。

1 研究方法

1.1 額爾敦-烏日勒活性成分的靶點分析

利用藥物口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，且類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件，通過篩選中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP數據庫)(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)、Swiss Target Prediction數據庫(http：//www.swisstargetprediction.ch)和HERB數據庫(http：//herb.ac.cn/)預測出額爾敦-烏日勒的主要有效成分靶點，在UniProt數據庫(https：//www.uniprot.org/)中輸入有效成分對應的作用靶點，篩選條件為Human，將全部靶點統一為標準格式。

1.2 乳腺癌疾病潛在作用的靶點分析

檢索TTD(http：//db.idrblab.org/ttd/)、OMIM(https：//omim.org/)數據庫、Phenopedia數據庫(https：//phgkb.cdc.gov/PHGKB/startPagePhenoPedia.action)，以 “epilepsy”“breast carcinoma”“Seizures”為關鍵詞，檢索與癲癇相關的靶基因，獲得疾病的相關作用靶點。

1.3 數據處理

利用Venny圖對藥物的作用靶點與疾病相關的作用靶點進行交集，所得出的交集靶點為額爾敦-烏日勒治療癲癇的關鍵靶點。

1.4 藥物成分-疾病-關鍵靶點網絡的建立

應用Cytoscape 3.7.2軟件繪制并建立“藥物成分-疾病-關鍵靶點”關系網絡，網絡外圍節點代表疾病與藥物成分的關鍵靶點，整個網絡將展示藥物成分-疾病-關鍵靶點之間的聯系，通過構建這一網絡，探究額爾敦-烏日勒抗癲癇的作用機制。

1.5 關鍵靶點蛋白相互作用網絡的構建

利用STRING數據庫在線平臺(https：//string-db.org/)，預測關鍵靶點的蛋白相互作用關系。將藥物與疾病交集作用靶點的文件導入到STRING數據庫，將研究物種設置為人類(Homo sapiens)，其他參數保持默認設置。利用Multiple proteins工具，構建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡模型，獲得關鍵靶點蛋白相互作用(PPI)網絡。

1.6 GO富集分析和KEGG通路分析

利用AmiGO2平臺(http：//amigo.geneontology.org/amigo)和bioinformatics平臺(http：//www.bioinformatics.com.cn/login/)，對獲得的基因進行GO富集分析和KEGG通路分析，以P<0.05作為篩選條件，分別繪制出通路圖和dotplot點圖。

1.7 關鍵作用位點與額爾敦-烏日勒主要成分的分子對接

選取額爾敦-烏日勒內關鍵成分與潛在的作用位點，利用AutodockTools1.5.6進行分子對接，驗證所預測關鍵靶點與藥物主要活性成分之間的結合效果。其具體操作方法為：①在PubChem數據庫中檢索獲得額爾敦-烏日勒主要活性成分的SDF結構文件，利用Chem3D軟件及AutoDockTools1.5.6軟件將SDF文件轉化為PDBQT文件；②在Protein Data Bank數據庫(http：//www1.rcsb.org/)中檢索出并獲得關鍵蛋白的PDB格式，利用PYMOL 2.3.4軟件去除獲得蛋白中的水分子及小分子配體。利用AutoDockTools1.5.6軟件對獲得蛋白進行加氫、平衡電荷等操作，將其保存為PDBQT文件；③在AutoDockTools1.5.6中利用Grid Box命令打開Grid Options工具對每個受體蛋白進行處理，通過設置配體盒子的中心位點和大小，將受體蛋白轉化為PDBQT文件；④利用AutoDock Vina對受體蛋白與配體小分子分別進行分子對接，結合能(affinity)打分及對接參數。結合能數值越低，代表受體-配體復合物具有越好的結合效果；⑤選取與配體分子結合效果好的靶點，輸出分子對接模擬圖，采用PyMOL 2.3.4軟件將分子對接模擬圖及可能的結合位點結果可視化。

2 結果

2.1 額爾敦-烏日勒抗乳腺癌的潛在作用靶點預測

通過TCMSP數據庫和Swiss Target Prediction數據庫檢索，獲得其中收錄的額爾敦-烏日勒中主要作用靶點共246個。檢索OMIM數據庫、Phenopedia數據庫、TTD數據庫，共檢索到癲癇潛在作用靶點1 250個。整合獲得數據，去除重復項，共有乳腺癌潛在作用靶點1 076個。利用Venny圖對藥物的作用靶點與疾病相關靶點進行交集，共獲得關鍵靶點47個，見圖1。共獲得關鍵靶點AR、NOS2、GSK3B、GRIA2、GABRA1、PTGS2、EGFR、AKT1、TNF、HIBCH、NR1I2、PRKCB、AKR1B1、MAOA、ADORA1、GLO1、APP、MMP9、CYP1B1、ABCG2、ABCC1、ACHE、ABCB1、TERT、F2、DRD4、GRM1、MTNR1B、SLC6A3、EPHX1、P2RX7、TNFRSF1B、SLC6A4、SCN5A、CHRNA7、CHRM3、CHRM1、CYP1A1、CASP8、HTR2A、PPARG、ALDH2、CASP1、MMP8、ITGA4、ITGB3、BRAF，共47個。

圖1 額爾敦-烏日勒中主要作用靶點及關鍵靶點

2.2 藥物成分-疾病-關鍵靶點網絡的建立與分析

將額爾敦-烏日勒的主要作用靶點和癲癇疾病相關疾病靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建藥物成分-疾病-關鍵靶點網絡(圖2)。左側圖的中心位置為癲癇疾病，右側圖的中心位置為額爾敦-烏日勒成分，周圍節點為兩者共同相關基因。圖中共有藥物和疾病共同靶點47個，共1 275個節點，節點與節點之間的作用關系——即“邊”，共有1 342條“邊”。

圖2 藥物成分-疾病-關鍵靶點網絡

2.3 蛋白質-蛋白質互相作用網絡的構建

將47個共同靶點導入STRING數據庫中，構建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡模型，如圖3所示。在PPI網絡中，“邊”代表作用靶點之間的關聯，其粗細用combine score表示，“邊”越粗，combine score值越大，代表其結合度越大；節點代表作用靶點。由導出結果可知，該網絡模型共有47個節點、207條邊，平均節點度(Degree)為8.81，Degree值越大即表示該靶點處于網絡的核心地位，經可視化處理后得到圖3，Degree值越大具有更大的圖像和更亮的顏色，如共同靶點中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、淀粉樣前體蛋白(APP)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、腫瘤壞死因子(TNF)及表皮生長因子受體(EGFR)這些蛋白在藥物治療疾病的調控過程中起關鍵作用。

圖3 蛋白質-蛋白質互相作用網絡

2.4 GO富集分析

在GO富集分析結果中，選取P值排名前5的生物功能(Biological processes，BP)，可得額爾敦-烏日勒主要影響包括鞘脂易位作用、多巴胺能對突觸傳遞的負調節、受體生物合成過程、白細胞介素1α分泌的正調控和異種運輸。其細胞成分(Cellular component，CC)膠質細胞投射、轉移酶復合物-轉移含磷基團、軸突、整合素復合物和主軸突。其分子功能(Molecular function，MF)排名前5的分別是外源性跨膜轉運ATP酶活性、G蛋白偶聯的乙酰膽堿受體活性、多巴胺、鈉共轉運蛋白活性、乙酰膽堿結合和鞘脂轉運蛋白活性，見圖4。

圖4 GO富集分析

2.5 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結果顯示，47個關鍵靶點顯著富集在68條通路上(P<0.05)，其靶點主要作用于包括色氨酸代謝通路、抗葉酸通路、組氨酸代謝通路、肌萎縮性側索硬化癥(ALS)、神經活性配體-受體相互作用和鈣信號通路等通路中，提示額爾敦-烏日勒通過多種作用、多條通路發揮治療癲癇的作用，見圖5。將KEGG通路富集情況經可視化處理，通路中富集的靶點數目越多，所對應圓圈越大；顏色越深，則藥物對應靶點越可能為乳腺癌治療靶點，如圖6所示；其中有關5-羥色胺能突觸通路影響最為明顯。

圖5 KEGG通路富集分析

圖6 KEGG通路富集情況可視化處理

選取藥物成分-疾病-關鍵靶點網絡高于平均值的靶點，選取額爾敦-烏日勒中主要成分異鼠李素(isorhamnetin)、木犀草素(luteolin)、異牧荊素(isovitexin)、牛磺膽酸鈉(Deoxycholic Acid)和3-甲基環十五烷酮(3-Methyl desoxycholate)與靶點進行分子對接，結合能<-7.0 kcal·mol-1表示具有較好的結合效果，對接的效果與結合能負值大小呈正相關。分子對接情況，如表1所示。結果顯示，化合物與靶蛋白的最低結合能都<0，說明配體與受體可以自發結合，其中aldh2-木犀草素、Cyp1a1-木犀草素、Casp8-3-甲基環十五烷酮結合能較低，其分子對接模式見表1和圖7-圖10。

圖7 Cyp1a1-木犀草素及結合位點

圖8 aldh2-木犀草素及結合位點

圖9 Casp8-3-甲基環十五烷酮及結合位點

圖10 MAOa-甲基環十五烷酮及結合位點

表1 關鍵靶點與其相關化合物的結合能

3 討論

現代研究表明，額爾敦-烏日勒具有治療白脈病的功效，白脈病指的是神經系統疾病，一般癥狀是渾身抽搐、口眼歪斜等，這與臨床醫學中的癲癇相對應[7]。在已有研究中，額爾敦-烏日勒被證實具有減輕腦電圖與肌電圖在彌漫性不規則中、高波幅混合慢波上，夾雜大量雜亂多灶性棘波、尖波等癲癇特異性腦電圖的效果[8]，但其具體機制尚未明確，因此探索額爾敦-烏日勒的主要成分及其在治療癲癇方面的主要作用位點，有助于進一步探討癲癇的發生機制并為開發靶向治療藥物提供理論依據。

額爾敦-烏日勒中的黃酮類化合物具有調節炎癥和細胞生存相關的microRNA表達的特性，可緩解癲癇發作時口眼歪斜和四肢抽搐等癥狀[9]，額爾敦-烏日勒中木犀草素可通過降低表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)的 mRNA 表達，從而抑制 EGF 介導氧化磷酸化、ERK 和 MARK-PI3K-Akt信號通路激活[10-11]，可增強腦內神經膠質細胞穩定性，從而抵抗癲癇發生[12]。鄭新元等[13]研究發現，從藥物抗癲癇活性部位中提取出的總黃酮含量越高，其抗癲癇的作用也越強。因此在一定的劑量下，額爾敦-烏日勒能顯著抑制大鼠癲癇的發生[14]。黃酮類化合物是導致海馬環磷腺苷效應元件蛋白(CREB)磷酸化，進而導致細胞外信號調節激酶(ERK)和腦源性神經營養因子(BDNF)升高的一種多酚類化合物。類黃酮家族幾個成員也可通過CREB-BDNF通路的相互作用表現出對癲癇發作的抑制[15]。在國外學者的研究中，黃酮類化合物可通過增強海馬內星形膠質細胞中BDNF的表達發揮神經保護作用，可提高神經元對于癲癇發生時局部異常放電刺激的抵抗能力，從而降低癲癇的發作強度和發作時間[16-17]。

本研究中，額爾敦-烏日勒中黃酮類化合物對于caspase-8、caspase-9、MAOA等位點具有較高的親和性。有證據表明，癲癇發作停止是由于誘導細胞程序性死亡的結果，有關的癲癇凋亡標記物caspase-1、caspase-2、caspase-8、caspase-9與全身性癲癇的發作呈正相關[18]。其中的caspase-8比caspase-9能更有效阻斷癲癇誘導細胞死亡[19]。癲癇的發作多由于腦中5-HT不足引起，單胺氧化酶(MAOA)可以降解5-HT這種抑制性神經遞質，5-HT濃度的降低可能導致神經調質系統的失衡[20]，導致腦內神經突觸異常，從而增加癲癇發生的可能性。在另一些研究中，部分學者發現針對抑制MAOA的治療已被證實有強有力的抗驚厥能力，對于癲癇的治療具有良好的效果[19]。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學的手段對額爾敦-烏日勒的主要活性成分及藥理作用，以及與癲癇作用通路的關系進行了分析，闡述了額爾敦-烏日勒通過多靶點、多通路的復雜作用機制調節癲癇相關信號表達從而達到抗癲癇的作用，為進行更深入的相關實驗研究奠定了基礎，同時也為進一步研究一種潛在的、安全有效的癲癇輔助用藥提供了新思路。