一株反硝化聚磷菌的篩選鑒定及脫氮除磷性能研究

羅 俊，孫 霞,2，劉 揚，張 虎

(1.湖南百舸水利建設股份有限公司, 湖南 長沙 410007;2.山東江河濕地生態研究院, 山東 濟南 271100;3.中國水利水電科學研究院, 北京100080)

0 引言

洞庭湖是我國第二大淡水湖，由于工農業廢水污染、航運、水產養殖等因素，其富營養化問題日漸凸顯。《2018年中國生態環境狀況公報》發布的淡水環境狀況表明，洞庭湖為中度營養化狀態，水質為Ⅳ類，主要污染指標為總氮、總磷。黃代中等[1]近20年的研究發現，洞庭湖區的營養化狀況呈惡化趨勢，特別是東洞庭湖，已由中營養化過渡為輕度富營養化。因此改善洞庭湖區水質和富營養化狀況，加快水體脫氮除磷研究尤為迫切。

利用生物法同步去除氮磷被認為是最經濟有效的方式，但是在傳統的生物脫氮除磷過程中存在硝化菌和聚磷菌菌齡不同，碳源需求競爭等諸多矛盾。20世紀80年代，Osborn以及Bortone等相繼發現某些反硝化菌在硝酸鹽存在情況下具有吸磷功能[2-3]，后來，研究者陸續發現某些聚磷菌可以利用亞硝酸鹽為最終電子受體進行吸磷，隨后一些兼具脫氮和除磷特性的反硝化聚磷菌被分離出來，使得脫氮除磷同步進行成為可能。已報道的反硝化聚磷菌有不動桿菌屬 (Acinetobacter)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、 氣單胞菌屬(Aeromonas)、 副球菌屬 (Paracoccus)、 寡營養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、莫拉氏菌屬 (Moraxella) 和腸桿菌屬 (Enterobacter) 等[4-6]。

本研究從洞庭湖底泥中分離篩選出1株高效反硝化聚磷菌，并考察了菌株對人工合成模擬湖水的脫氮除磷效果，以期為反硝化聚磷菌處理富營養化水體提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株來源

試驗樣品于2018年7月采自洞庭湖底泥，樣品低溫保存，及時帶回實驗室分離菌株。

1.1.2 培養基

富集培養基(g/L)：CH3COONa·3H2O 3.32，KH2PO40.04; NH4Cl 0.305，KNO30.3，MgSO4·7H2O 0.091，CaCl2·2H2O 0.026，NaCl 0.02，微量元素2mL，pH 7.2，用于反硝化聚磷菌的富集培養。

BTB培養基(g/L)：C4H4Na2O48.5，KNO31.0，KH2PO41.0，FeCl3·6H2O 0.5，MgSO4·7H2,1.0，CaCl2·7H2O 0.2，BTB(1%溶于酒精)1mL，pH 7.2，用于反硝化聚磷菌的初篩。

牛肉膏蛋白胨培養基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，瓊脂18-20，NaCl 5，pH 7.2，用于菌株的形態觀察、保存。

缺磷培養基 (g/L)：CH3COONa·3H2O 3.32，Na2HPO4·2H2O 0.023，MgSO4·7H2O 0.081，K2SO40.018，NH4Cl 0.153，CaCl2·2H2O 0.011，微量元素2mL，pH 7.2。

富磷培養基(g/L)：CH3COONa·3H2O 3.32，KH2PO40.04，MgSO4·7H2O 0.091，CaCl2·2H2O 0.026，NH4Cl 0.305，微量元素2mL，pH 7.2。

富氮富磷培養基(g/L)：CH3COONa·3H2O 3.32，KH2PO40.035，NH4Cl 0.305，KNO30.3，MgSO4·7H2O 0.091，CaCl2·2H2O 0.026，NaCl 0.02，微量元素2mL，pH 7.2。

微量元素溶液：Na2EDTA 63.7mg/L，MnCl2·4H2O 5.06mg/L，ZnSO42.2mg/L，FeSO4·7H2O 5.0mg/L，CaCl25.5mg/L，CuSO4·5H2O 1.57mg/L，Na2MoO4·4H2O 1.1mg/L，CoCl2·6H2O 1.61mg/L，pH 7.0。

1.1.3 人工合成模擬污水(g/L)

CH3COONa·3H2O 3.32，KH2PO40.035，NH4Cl 0.305，KNO30.3，MgSO4·7H2,0.091，CaCl20.02，NaCl 0.02，微量元素溶液 2mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株富集與分離

取10g泥樣接入90mL無菌水中，120r/min振蕩1h，靜置20min，取上清液2mL接種于100mL富集培養基中，28℃，120r/min振蕩培養24h，使微生物快速生長，達到富集的目的。如此重復接種培養3次后，將富集菌液梯度稀釋，取100μL稀釋液涂布于BTB平板，28℃培養2～3d，挑選周圍培養基出現藍色菌落，并用劃線法分離純化獲得單菌落。

1.2.2 菌株的初篩與復篩

將上述分離出的單菌落，接種于缺磷培養液中，28℃ 培養24h后，在轉速為10000rpm 的離心機中離心2min，取其上清液，用滅菌水洗滌，重復3次，將菌體細胞重懸于富磷培養基中，在恒溫 28℃的搖床上培養 24h，然后對培養液離心，取其上清液，測定分析接種前后TP濃度的變化，對除磷率高于 50% 的菌株接種于富氮富磷培養基中，28℃，120r/min搖床培養24h后，對TP和TN的含量進行測定，既能夠脫氮又能夠除磷的菌株即為本實驗的目標菌株。

1.2.3 菌株鑒定

經革蘭氏染色顯微觀察其形態，再結合其生理生化和菌落特征進行初步鑒定，然后委托北京諾賽基因組研究中心對16S rRNA的PCR擴增產物進行序列測定，應用BLAST軟件將所得序列與GenBank中的序列進行同源性分析。

1.2.4 生長曲線測定

菌株的生長情況采用比濁法測定，利用分光光度計以OD600表示。在30℃，pH7.2，120r/min培養條件下，每2h取樣測定一次。

1.2.5 DT4-2菌株對模擬污水的凈化

將復篩效果較好的DT4-2菌株接種至牛肉膏蛋白胨培養液中，28℃，120r/min振蕩培養12h，取3mL菌液離心棄上清，沉淀用無菌水清洗2次，重懸至模擬污水反應體系中，用250mL三角瓶作為反應器，28℃，120r/min振蕩培養，定時取培養液，10000rpm離心，測定上清液總磷、總氮含量。

1.2.6 外界因素對凈化效果的影響

改變外界環境因素，如溫度、接種量、作用時間等，按照1.2.5方法測定不同條件下模擬污水中接種前后氮、磷含量變化，計算分析其對TN、TP的去除效率。

1.2.7 測定方法

總氮采用堿性過硫酸鉀分光光度法測定，總磷采用鉬銻抗分光光度法測定，具體操作步驟參照《水和廢水監測分析方法》(第四版)[5]。

2 結果與分析

2.1 菌株的鑒定

通過富集培養、初篩復篩等方法，篩選獲得菌株DT4-2的脫氮除磷效果優于其他菌株，因而選擇DT4-2作為后續實驗菌株。經過形態觀察發現，DT4-2為革蘭氏陰性菌，半固體培養基穿刺實驗表明無鞭毛，不能游動。菌落呈圓形，光滑濕潤，近白色，不透明 (圖1)。將菌株DT4-2的16s rRNA序列與GenBank數據庫中的基因序列BLAST比對，結果顯示DT4-2與Gemmobacter lanyuensis的相似性達99%，因此初步鑒定菌株DT4-2為Gemmobacter lanyuensis。

圖1 菌株DT4-2的菌落

2.2 菌株DT4-2的生長曲線

對篩選得到的DT4-2菌株進行生長曲線測定，得到典型的“S型曲線”(圖2)。從圖2可以看出，菌株DT4-2的延滯期不足2h，說明該菌株能很快適應新環境，3h以后進入對數生長期，12h后菌株進入穩定期，OD600值穩定在1.8左右，24h后出現衰退趨勢。說明菌株DT4-2易于培養，穩定期持續時間較長，具有潛在應用價值。因此后續凈水實驗中確定該菌株的活化培養時間為12h，此時菌株的生長速率最大，生物活性最高。

2.3 不同接種量菌體在模擬水中的生長狀況

為確定獲得最佳凈水效果的接種量，將DT4-2按不同接種量接種于人工模擬水中，其生長情況見圖3。除接種量為0的體系中OD600值始終保持為0外，不同接種量下培養體系的OD600值均隨著培養時間的延長而上升。在三個研究時間點中，以2%的接種量菌株的生長最佳，各接種量下菌株的生長表現為OD600-2%>OD600-10%>OD600-4%≈OD600-8%>OD600-6%，因此后續實驗使用2%的接種量。

圖2 菌株DT4-2的生長曲線

圖3 不同接種量-培養時間下菌株DT4-2的生長情況

圖4 菌株DT4-2在不同作用時間下的脫氮除磷效果 圖5 菌株DT4-2在不同溫度下的脫氮除磷效果

2.4 作用時間對凈水效果的影響

以2%的接種量接種于人工模擬水中，考察獲得最佳脫氮除磷效果的作用時間，結果如圖4所示。從圖4可以看出，在模擬水反應體系中，DT4-2菌株對氮和磷的去除時間相差較大。菌株在模擬水反應體系中作用3h后就有快速除磷的效果，作用8h對磷的去除率達到96.7%。而對氮的去除所需時間較長，作用6h后才顯示對氮的快速降解，24h后達到平穩上升的階段，作用60h，最大除氮率達到83.3%。

2.5 溫度對凈水效果的影響

溫度對該菌株脫氮除磷效果的影響如圖5所示，當溫度為25℃時，菌株對磷的去除達到最大值，去除率為92.9%；當溫度30℃時，脫氮效果較好，對氮的去除率為67.8%；當溫度超過30℃，脫氮除磷的效果逐漸減弱，因此該菌株對污水脫氮除磷的最適溫度為25～30℃。

3 結論

(1)通過富集培養、BTB平板涂布篩選、平板劃線純化等方法，從洞庭湖水體和底泥中分離菌株，經復篩得到1株脫氮除磷效果較好的菌株DT4-2。

(2)結合形態特征和16s rRNA基因序列分析，確定菌株DT4-2為 芽殖桿菌屬中的Gemmobacterlanyuensis。本研究篩選獲得的芽殖桿菌屬在反硝化聚磷菌的研究報道中較少見。

(3)人工合成富營養化水體的凈化實驗表明，初始接種量為2%時，菌體生長狀況最好，在反應體系中作用8h除磷率可達96.7%，作用60h，除氮率可達到83.3%。該菌株適合的脫氮除磷溫度為25～30℃。