褪黑素隱形脂質體的制備及體外透皮釋藥性能的研究

張政，閆福鵬，楊程皓，劉晨雨，王友朝，周田田，郝吉福

［山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）藥學院，山東 泰安 271016］

褪黑素（melatonin,MLT）是松果體分泌的內源性神經激素，影響晝夜節律和細胞功能[1?4]。由于褪黑素只在夜間分泌并且分泌量極少，而一些時差綜合征會使褪黑素的分泌失衡，進而導致睡眠規律紊亂，此時往往需要補充外源性褪黑素來調整機體的生理功能[5?6]。褪黑素作為一種吲哚雜環化合物，具有較低的水溶性和較高的滲透性，在生物藥劑學分類系統中將其劃分為Ⅱ型藥物。褪黑素作為自由基清除劑及抗氧劑被廣泛用于臨床治療中[7]。盡管口服給藥常作為臨床首選的給藥形式，但褪黑素非常短的生物半衰期（t1/2＜30 min）、多變的影響吸收因素以及強烈的首過效應，使口服給藥難以作為MLT理想的遞送方式[8?11]。因此，如何有效地遞送褪黑素成為亟待解決的問題。

皮膚作為最大的潛在給藥組織，經皮遞送能夠避免肝臟的清除，并能維持恒定的血藥濃度[12?14]。隱形脂質體（stealth liposomes,SLs）是指將藥物包封于脂質雙分子層中，并且在成膜材料中加入適量膜軟化劑（主要是表面活性劑膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、吐溫、司盤等）形成的雙層囊泡結構[15?17]。SLs具有高度的變形性及柔韌性，在滲透壓的驅動下，能夠攜載更多的藥物穿過皮膚角質層屏障進入體內，進而提高藥物經皮遞送的效率[18?19]。以SLs作為經皮遞送的載體時，能夠與皮膚角質層發生融合，易于變形穿過角質層屏障，在皮膚表面累積形成濃度梯度，促進經皮遞送效率，SLs被證明是最有效的藥物經皮遞送方式之一。

因此，本研究采用薄膜水化法制備荷載褪黑素的隱形脂質體，并采用Franz擴散池法對褪黑素隱形脂質體的體外經皮滲透試驗進行了研究，探討褪黑素隱形脂質體應用于經皮遞送的可行性，為褪黑素的應用提供新的遞送形式。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BT25S電子分析天平（德國Sartorius公司）；LC?10A高效液相色譜儀（蘇州島津分析儀器有限公司）；Nano?S90激光粒度分析儀（英國Malvern公司）；RYJ?6A透皮擴散實驗儀（上海黃海藥檢儀器廠）；3K30超速離心機（德國Sigma）；RE?52A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；JY92?2D超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技公司）；JEM?1200EX透射電鏡（日本JEOL公司）。

1.2 藥品與試劑

褪黑素（純度98%，批號：118674，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；褪黑素對照品（批號520023?201301，中國食品藥品檢定研究院，純度99.8%）；卵磷脂及膽固醇（上海艾偉拓醫藥科技有限公司）；脫氧膽酸鈉（純度≥99%，北京索萊寶科技有限公司）；三氯甲烷、乙醇等試劑為分析純。

1.3 動物

昆明種小鼠，體質量（25±5）g，由山東魯抗醫藥股份有限公司實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號為SCXK（魯）20080002。

2 方法與結果

2.1 褪黑素隱形脂質體的制備

采用薄膜水化法制備褪黑素隱形脂質體[20]：精密稱取褪黑素20.0 mg、卵磷脂80.0 mg、膽固醇20.0 mg和脫氧膽酸鈉19.0 mg，共同置于圓底燒瓶中，然后加入10 mL三氯甲烷和無水乙醇的混合溶液使完全溶解，于40℃減壓旋轉蒸發揮干有機溶劑，在瓶壁上形成薄膜，隨后加入10 mL蒸餾水使充分水化，最后采用超聲波細胞粉碎機超聲15 min，即得褪黑素隱形脂質體。

在隱形脂質體的處方中分別去掉褪黑素和脫氧膽酸鈉，同法可相應地制備空白隱形脂質體及褪黑素普通脂質體。

2.2 褪黑素柔性脂質體粒徑測定及形貌觀察

取上述制備好的褪黑素脂質體100μL，用超純水稀釋至1 mL，采用激光粒度儀測定粒徑大小。分別取適量制備好的褪黑素隱形脂質體和空白隱形脂質體滴加到有碳膜的銅網上，靜止數分鐘后，用濾紙吸去多余的液體，2%磷鎢鉬酸進行負染，干燥后采用透射電鏡（TEM）觀察所制備褪黑素隱形脂質體的外觀形貌。

由圖1A和圖1B的粒徑分布結果可見：所制備的褪黑素隱形脂質體的平均粒徑為（48.87±1.56）nm，PDⅠ為0.203；空白隱形脂質體的平均粒徑為（68.77±2.21）nm，PDⅠ為0.260，表明所制備的脂質體平均粒徑小于100 nm，且分布較為均勻（PDⅠ＜0.3）。TEM檢測結果（圖1C和圖1D）顯示，所制備的脂質體呈規整的圓球狀，無聚集現象。

圖1 隱形脂質體的粒徑分布圖及透射電鏡圖Figure 1 The diagrams of the particle size distribution and TEM of MLT SLs

2.3 褪黑素隱形脂質體包封率和載藥量測定

采用超濾離心法測定褪黑素隱形脂質體的包封率和載藥量[21]。精密量取所制備的褪黑素隱形脂質體溶液200μL，置于超濾離心管中（截留相對分子質量4 000），在4℃條件下，8 000 r/min離心20 min。精密量取超濾管外管中溶液50μL，加入4.0 mL甲醇，采用HPLC法測定褪黑素濃度，根據標準曲線計算褪黑素含量，將其作為游離褪黑素的量。根據以下公式計算脂質體的包封率（EE）和載藥量（DL）：

其中：M表示隱形脂質體中褪黑素總投藥量；M1表示隱形脂質體中游離的褪黑素藥物含量；W表示隱形脂質體中磷脂、膽固醇、脫氧膽酸鈉及藥物的總質量。

結果表明所制備的褪黑素隱形脂質體的包封率和載藥量分別為73.91%和9.92%。

2.4 體外經皮滲透試驗

2.4.1 離體小鼠皮膚的制備 將昆明小鼠用脫毛膏脫去腹部毛發后，生理鹽水洗凈，飼養24 h后頸椎脫臼處死，剝離脫毛的腹部皮膚，去除皮下脂肪組織，然后用生理鹽水清洗干凈后待用。

2.4.2 體外經皮滲透試驗 采用改良的Franz擴散池中進行體外經皮滲透試驗。將制備好的小鼠皮膚平鋪在Franz擴散池的供給池和接收池中間，用特定的夾子固定，皮膚角質層朝向供給池，擴散池的有效滲透面積為3.5 cm2，接收池體積為6.5 mL，磷酸鹽緩沖液（pH 7.2~7.4）作為接收介質。將Franz擴散池放置在藥物透皮擴散試驗儀支架中，溫度設置為37℃，攪拌速度維持300 r/min恒速攪拌。然后將1.0 mL褪黑素隱形脂質體與褪黑素普通脂質體均勻涂布在小鼠皮膚的角質層表面，分別在0.5、1、2、3、4、6、8、10、24 h時取樣，每次取樣體積為3.0 mL，每次取樣后補加等溫度、等量的磷酸鹽緩沖液。

2.4.3 樣品測定方法及數據處理

2.4.3.1 褪黑素紫外吸收波長的確定 精密稱取褪黑素對照品5.03 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容至刻度，以甲醇為空白對照，用紫外分光光度計在200~400 nm波長范圍內進行掃描，結果表明褪黑素在223 nm波長處有最大吸收。

2.4.3.2 褪黑素標準曲線的制備 精密稱取褪黑素4.0 mg，置于50 mL的容量瓶中，加入甲醇溶液后搖勻使充分溶解，定容至刻度，作為儲備液。取儲備液適量，用甲醇稀釋分別制成質量濃度為0.010、0.015、0.020、0.030、0.035、0.040 mg/mL的系列標準溶液。取上述系列質量濃度的褪黑素溶液適量，分別在223 nm處測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標、質量濃度（C）為橫坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程A=23.76C-0.075，R2=0.999 4，表明褪黑素在0.01~0.04 mg/mL質量濃度范圍內線性關系良好。

2.4.3.3 精密度及穩定性試驗 取質量濃度分別為10.0、20.0、40.0μg/mL的褪黑素溶液，在223 nm處測定吸光度，連續測定5次，考察不同質量濃度下的精密度。結果表明所測得低、中、高3種質量濃度褪黑素溶液的RSD均小于2.0%，符合方法學要求。

取質量濃度分別為10.0、20.0、40.0μg/mL的褪黑素溶液，分別于配制后0、4、8、12、24、48、72 h于223 nm處測定吸光度，結果表明所測得低、中、高3種質量濃度褪黑素溶液的吸光度RSD值均小于5.0%，符合方法學要求。

2.4.3.4 體外透皮釋放樣品測定及數據處理 取出的接收液用0.45μm微孔濾膜濾過后，棄去初濾液，續濾液用于測定褪黑素的濃度。于223 nm波長處測定吸光度，根據標準曲線回歸方程計算不同時刻褪黑素脂質體經皮滲透量。根據下列公式計算累積滲透量（Q）、透皮速率常數（Jss）及滲透系數（P）：

式中：S為Franz有效擴散面積（cm2）；V為接收池中接收液體積（mL）；Ci為第一次至上次取樣時接收液中藥物質量濃度（mg/mL）；Cn為n時間點測得的藥物質量濃度（mg/mL）：Vi為取樣體積（mL）；V為接收池中的接收液的總體積（mL）。

以褪黑素體外經皮的累積滲透量為縱坐標、時間為橫坐標，繪制2種類型的褪黑素脂質體經皮累積滲透量曲線，結果如圖2所示。對曲線中的直線部分進行線性回歸，計算滲透動力學參數，結果見表1。

表1 褪黑素脂質體體外經皮滲透動力學參數表Table 1 The parameters of in vitro transdermal penetration of melatonin(stealth)liposomes

圖2 褪黑素脂質體的體外經皮累積釋放量曲線Figure 2 In vitro transdermal penetration profiles of melatonin(stealth)liposomes

可見，褪黑素隱形脂質體和普通脂質體24h單位面積累積滲透量（Q）分別為0.251 4、0.165 5 mg/cm2，透皮速率常數（Jss）分別為0.017 6、0.008 7mg/（cm2·h）。結果表明，與普通脂質體組相比，褪黑素隱形脂質體單位面積累積滲透量和滲透速率分別提高了1.5倍和2倍，顯示出較快的滲透性。由圖2可知，隨著時間的推移，隱形脂質體的單位面積累積滲透量較普通脂質體越來越大。表明將褪黑素制備成隱形脂質體可進一步提高經皮透過效率。

2.5 褪黑素隱形脂質體透皮機制研究

2.5.1 皮膚表面掃描電子顯微鏡（SEM）分析 采用SEM觀察給予褪黑素隱形脂質體后對皮膚角質層結構的影響。以生理鹽水作為對照，分別將生理鹽水和褪黑素隱形脂質體涂布于脫毛小鼠背部，12 h后處死小鼠，取下給藥部位的皮膚，置于戊二醛溶液中固定24 h，使用分級乙醇進行脫水干燥，將處理過的皮膚樣品進行SEM觀察，結果見圖3。

圖3 小鼠皮膚角質層掃描電鏡圖Figure 3 The SEM pictures of mice stratum corneum

從皮膚表面角質層結構來看，對照組皮膚表面粗糙，角質層細胞呈雜亂層堆狀不規則排列，角質層細胞間隙不明顯。經隱形脂質體處理后的皮膚表面比較平整光滑，角質層細胞水化程度較高，細胞間隙明顯增加。

2.5.2 皮膚結構的差示掃描量熱法（DSC）及紅外光譜（FTⅠR）分析 將經生理鹽水和褪黑素隱形脂質體處理12 h后的小鼠背部皮膚取下，用研缽研磨（研磨過程中不斷加入液氮，以免皮膚軟化粘連），然后置于冷凍干燥機中進行凍干，將獲得皮膚凍干粉分別進行DSC及FTⅠR測定。其中DSC測定條件：測試溫度設定為20~250℃，加熱速率為10℃/min，并在氮氣保護下進行測定。FTⅠR測定：將皮膚凍干粉與KBr壓片后在400~4 000 cm-1掃描范圍內用紅外光譜儀進行光譜掃描。結果見圖4。

從DSC曲線（圖4A）可知，在110~120℃溫度范圍內出現角蛋白變性特征峰，與對照組相比，經隱形脂質體處理后角蛋白熔點升高，表明角蛋白的螺旋結構發生變化。

從紅外結果（圖4B）可知，皮膚樣品的紅外特征吸收峰為角質層脂質峰（νasCH2，νsCH2，νsC=O）和角蛋白峰（酰胺Ⅰ，酰胺Ⅱ）。與對照組相比，經隱形脂質體處理后，角質層脂質峰發生右移，提示制備脂質體所使用的磷脂可以改變角質層的脂質結構，能夠影響皮膚角質層中的脂質的流動性。

圖4 小鼠皮膚的DSC圖（A）和FTⅠR圖譜（B）Figure 4 The DSC(A)and FTⅠR(B)profiles of mice skin

3 討論

本研究以磷脂、膽固醇及脫氧膽酸鈉為成膜材料，采用薄膜水化法制備荷載褪黑素的隱形脂質體，并通過粒度分析及透射電鏡對所制備的脂質體進行了表征。結果顯示所制備的隱形脂質體粒徑分布小于100 nm，外觀呈規則的圓球狀，符合納米載體的特征，同時具有較高的包封率和載藥量。但荷載褪黑素隱形脂質體的粒徑比空白粒徑小，出現此現象的原因可能與模型藥物褪黑素具有兩親結構有關。其分子結構中含有親水的酰胺基團，另一側為疏水的苯環結構，模型藥物本身具有兩親結構，加入后能夠更大程度地降低表面張力，使形成的脂質體的粒徑減小。

體外經皮滲透試驗研究結果顯示，褪黑素隱形脂質體緩慢釋放，由于內源性物質的褪黑素分泌后能夠迅速進入血液循環分布到機體各部分，在體內的含量極少，以pg級（1×10-12g）水平存在，因此推測痕量的藥物能夠改善睡眠障礙。然而，目前仍缺少有效的評價實驗動物睡眠障礙的模型，藥效學研究尚需在后續中進一步開展。

與褪黑素普通脂質體相比較，隱形脂質體24 h的單位面積累積滲透量明顯高于普通脂質體組，這可能是由于脫氧膽酸鈉插入磷脂雙分子層中間，增加了磷脂分子間的距離，改變了磷脂酰基鏈的順序，增加了脂質膜的流動性，使隱形脂質體具有高度的變形能力，可以借助于自身發生形變的能力順利通過皮膚角質層。其次，隱形脂質體中的磷脂可與皮膚角質層中的脂質層融合，使角質層中的脂質組成和結構發生改變；此外，隱形脂質體可增加角質層的水合作用，使角質細胞間隙增大，從而導致皮膚角質層的屏障作用發生逆轉，SEM結果進一步證實，經隱形脂質體處理后皮膚表面的角質層結構細胞間隙明顯增加，表明隱形脂質體可改變皮膚角質層的致密結構，為藥物順利通過角質層屏障奠定了基礎。由DSC及FTⅠR結果可知，經隱形脂質體處理后，皮膚角蛋白和脂質結構發生了變化，表明隱形脂質體可通過改變角蛋白的螺旋結構來降低角質層的屏障功能，此外皮膚脂質中脂質酰基鏈的旋轉自由度增加，使皮膚脂質的流動性增加，繼而導致滲透性增強[22]。

綜上所述，本研究制備荷載褪黑素的隱形脂質體并進行了體外經皮滲透試驗，探討了其作為載體促進經皮吸收的促透機制，為褪黑素的進一步開發和利用提供了新的給藥形式，后續工作將進行相關的藥效學研究，以期為睡眠障礙提供新的治療策略。