廣藿香醇對脂肪酸誘導原代小鼠肝細胞脂質積蓄的作用及機制研究

唐東暉，鐘映芹，林重，韓亮，鐘艷花

（1.廣州市荔灣區中醫醫院針康科，廣東 廣州 510140；2.廣東藥科大學健康學院，廣東 廣州 510006）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種無過量飲酒史，由各種原因引起的肝細胞內脂肪堆積，以肝細胞脂肪變性和脂質蓄積為主要特征的臨床病理綜合征。其病理變化隨病程的進展表現有單純性脂肪肝、高脂血癥、高血壓，并被認為是代謝綜合征在肝臟的一種病理表現。NAFLD疾病譜包括單純性脂肪肝（NAFL）、脂肪性肝炎（NASH）及其相關肝硬化和肝細胞癌。我國NAFLD患病率約30%，由于其發病機制復雜，機制不清，臨床缺乏有效藥物，嚴重危害人民健康。

藿樸夏苓湯出自《醫原》，組方由11味中藥組成，能“理氣和中、燥濕利水”。方中君藥廣藿香配伍臣藥白蔻仁、厚樸、半夏，起“芳香化濕、燥濕運脾”之功效，使脾能運化水濕，不為濕邪所困。再配伍用茯苓、豬苓、澤瀉、薏苡仁、杏仁、淡豆豉和通草等佐使藥，起“開泄肺氣于上、滲利濕于下”之功效，使肺氣宣降、水道暢通，則水道自調，濕有去路。該方主治濕熱病邪在氣分而濕偏重者，中醫臨床上廣泛用于脾胃濕熱證等癥治療[1?2]。前期研究顯示，該方具有抗炎、降脂、保肝等藥理作用[3?8]。然而，關于其降脂機制及物質基礎尚不明確。本研究旨在小鼠原代肝細胞水平上觀察藿樸夏苓湯主要成分廣藿香醇對FXR信號的影響，探討藿樸夏苓湯降脂、抗NAFLD的作用機制及其物質基礎。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

雄性SPF級6~8周C57BL/6J小鼠，體質量18~20 g，購于廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（粵）2018?0002。雄性SPF級C57BL/6J背景FXR基因敲除小鼠，6~8周，購于南模生物（批號：NM?KO?190328）。

1.2 藥品與試劑

廣藿香醇（批號：HY?N0207）、厚樸酚（批號：HY?N0163）、和厚樸酚（批號：HY?N 0003）、乙酰澤瀉醇A（批號：HY?N 0853A）、乙酰澤瀉醇B（批號：HY?N 0805）、茯苓酸（批號：HY?N0371）、苦杏仁苷（批號：HY?N0190）、琥珀酸（批號：HY?N0420）、甘油三油酸酯（批號：HY?N1981）、油酸（OA，批號：HY?N1446）、棕櫚酸（PA，批號：HY?N0830）、奧貝膽酸（OCA，FXR陽性激動劑，批號：HY?12222）等對照品，均來源于美國MedChemExpress科研化學品和生物活性化合物供應商；HEK293T細胞株（批號：bio?72947），中國微生物菌種與細胞庫中心；pCD‐NA3.1?hFXR和pCDNA3.1?BSEP?luc質粒由中山大學黃民教授饋贈；FuGENE6轉染試劑（批號：E2691）、pCDNA3.1（批 號：E1751）和pGL3?CMV Renilla（批號：E2231），美國Promega公司；三酰甘油（TG）測定試劑盒（批號：A110?1?1），中國南京建成生物工程研究所；熒光探針DCFH?DA活性氧（ROS）檢測試劑盒（批號：A110?1?1），碧云天生物技術有限公司；PureLink?FFPE總RNA提取試劑盒（批號：K156002）、SuperScript?雙鏈cDNA合成試劑盒（批號：11917010），TaqMan?Gene Expression Mas‐ter Mix的real?time PCR反應液（批號：20200411）、小鼠TaqMan PCR探針、FXR探針（批號Mm004845 23_m1）、SHP探針（批號：Mm00442278_m1）、BSEP探針（Mm00445168_m1）、FASN探針（Mm00662319_m1）、CD36探針（Mm00432403_m1）、FABP1探針（Mm00444340_m1）和GAPDH探針（批號：Mm 99999915_g1），均購于美國Thermal?Fisher公司；FXR抗體（批號：ab129089），英國Abcam公司。

1.3 儀器與設備

Enspire plus多功能酶標儀（美國PerkinElmer公司）；BT3000全自動生化分析儀（意大利愛康公司）；BDU?700核酸蛋白分析儀（美國Beckman公司）；StepOne Plus Real?time熒光實時定量PCR儀（美國ABⅠ公司）；BX53奧林巴斯熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

2 方法

2.1 小鼠原代肝細胞分離

按照LⅠU等[9]報道的方法，采用膠原酶消化肝組織法分離C57BL/6J野生型小鼠和FXR敲除小鼠原代肝細胞（MPH）。具體操作步驟：小鼠采用戊巴比妥鈉麻醉后，75%（φ）乙醇皮膚消毒，打開腹腔，分離下腔靜脈，插管，立即注入1 mL肝素（100 U）。采用37℃的KrebsRinger灌流液Ⅰ（1 mmol/L NaHCO3、50 mmol/Lglucose、10 mmol/L NaCl、1 mol/L HEPES（p H7.45）、48 mmol/L KCl、12 mmol/L KH2PO4、12 mmol/L MgSO4和5 mmol/L EGTA）按20 mL/min流速進行肝臟灌注50 mL灌流液Ⅰ，灌入的同時剪開門靜脈。隨后采用含0.5 g/L膠原酶ⅠⅠ的灌流液Ⅱ（1 mmol/L NaHCO3、50 mmol/L glucose、10 mmol/L NaCl、1 mol/L HEPES（p H7.45）、48 mmol/L KCl、12 mmol/L KH2PO4、12 mmol/LMgSO4和1 mmol/L CaCl2）進行灌流約10 min至肝臟軟塌出現皸裂。剪下肝臟放置培養皿中，加入20 mL培養基，撕裂肝臟，形成肝細胞混懸液，細胞液用70μm細胞網濾過，收集濾液，50 g，離心3 min，棄上清，然后加入新鮮細胞培養基混懸。臺盼藍計數活細胞數（＞80%活細胞數用于后續實驗）。接種細胞，4 h后換液培養，并進行相關實驗。

2.2 細胞培養與處理

MPH和HEK293T細胞在37℃的5%（φ）CO2培養箱里，使用10%（φ）FBS、100μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培養基進行培養。MPH細胞按1×106種于6孔板中，細胞貼壁后，分為對照組（DMSO）、模型組、廣藿香醇低、中、高劑量組（5、10、20μmol/L）和OCA組（10μmol/L）。模型組采用OA+PA（體積比2∶1，1 mmol/L）誘導24 h模擬細胞內脂質積蓄模型，對照組給予相應的生理鹽水。各組細胞預先給予相應藥物作用24 h后，隨后加入OA+PA誘導24 h。

2.3 雙熒光素酶分析

HEK293T細胞按5×104種于24孔板中，貼壁后，細胞采用FuGENE6轉染試劑瞬時轉染pCD‐NA3.1（500 ng/孔，對 照 質 粒）、pCDNA3.1?hFXR（500 ng/孔）、pCDNA3.1?BSEP?luc（1 000 ng/孔）和pGL3?CMV Renilla熒光素酶質粒（100 ng/孔）12 h，然后加入10μmol/L相應藥物（OCA、廣藿香醇、和厚樸酚、厚樸酚、乙酰澤瀉醇A/B、茯苓酸、苦杏仁苷、琥珀酸、甘油三油酸酯等）治療24 h后，對照組給予DMSO作為溶劑對照，采用Enspire plus多功能酶標儀，按照Promega雙熒光素酶報告檢測的方法，測定各組藥物對BSEP?luc熒光素酶活性的影響。

2.4 免疫熒光分析

MPH按1×104種于24孔板中，廣藿香醇低、中、高劑量和OCA治療24 h后，PBS沖洗2次，10%（φ）多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗3次，0.5%Triton X?100/PBS通透10 min，PBS沖洗3次，5%BSA封閉30 min，FXRⅠ抗（1∶200）4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，加入FⅠTC熒光2抗，37℃避光孵育30 min，PBS沖洗3次，0.5μg/mL DAPⅠ染核5 min，PBS沖洗3次后，鏡檢。

2.5 ROS測定

MPH按1×104種于24孔板中，依次加入廣藿香醇、OA+PA分別治療24 h后，更換新鮮培養基，加入DCFH?DA熒光探針孵育4 h，按照ROS檢測試劑盒說明書進行操作，置于BX53奧林巴斯熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.6 MPH細胞脂質蓄積及TG含量測定

MPH細胞采用PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，60%（φ）異丙醇分化3 min，加入新鮮配置的油紅O染色液染色20 min，PBS沖洗3次，蘇木素染核30 s，PBS沖洗5次，置于顯微鏡下觀察并拍照。并將各組細胞消化后，收集細胞，按照TG檢測試劑盒說明書測定細胞內TG含量。

2.7 Real?time PCR測定細胞中FXR信號和脂質合成相關基因mRNA表達水平

MPH細胞采用PBS沖洗2次，經Trizol試劑提取、純化總mRNA、cDNA逆轉錄等步驟后，采用StepOne Plus Real?time熒光實時定量qPCR儀測定細胞中FXR、SHP、BSEP、FASN、CD36和FABP1的mRNA相對表達量。Real?time PCR反應體系：cDNA模板5μL，TaqMan探針1μL，ddH2O 4μL，TaqMan Fast Advanced Master Mix 10μL，總體積20μL。擴增條件：95℃2 min；95℃5 s、60℃30 s測定，40個循環。記錄各組樣品Ct值，以GAPDH作為內參基因，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

2.8 統計學方法

各項指標測定結果以表示，用Stata11.0統計軟件進行統計，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD?t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 藿樸夏苓湯成分廣藿香醇對FXR信號的影響

為篩選激動FXR的成分，本研究對藿樸夏苓湯中代表性化學成分進行了BSEP?luc熒光素酶報告基因活性分析。如圖1所示，與對照組比較，陽性對照藥OCA、廣藿香醇和乙酰澤瀉醇A/B顯著提高BSEP?luc熒光素酶報告基因活性，結果提示廣藿香醇和乙酰澤瀉醇A/B可激動FXR信號。

圖1 藿樸夏苓湯成分廣藿香醇對FXR信號的作用Figure 1 Patchoulialcohol activated FXRsignaling in MPH cells(±s，n=3)

考慮到廣藿香是藿樸夏苓湯方中的君藥，隨后的實驗都采用廣藿香醇作為研究對象。與熒光素酶活性測定結果一致，與對照組比較，免疫熒光分析顯示廣藿香醇和OCA可提高MPH細胞內FXR的蛋白水平，并促進FXR入核作用。此外，與對照組比較，廣藿香醇中、高劑量組可顯著提高FXR及其下游靶基因SHP和BSEP的mRNA表達水平，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

以上結果提示廣藿香醇可激動FXR信號，可能是藿樸夏苓湯發揮降脂、抗NAFLD作用的關鍵成分之一。

3.2 廣藿香醇對OA+PA誘導MPH細胞脂質水平的影響

與對照組比較，油紅O染色實驗顯示，模型組中MPH細胞內紅色脂滴聚集和TG水平明顯增加，表明OA+PA誘導的細胞內脂質堆積增加。與模型組比較，廣藿香醇中、高劑量組均可明顯降低細胞內紅色脂滴聚集和細胞內TG水平，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結果表明，廣藿香醇可顯著降低OA+PA誘導的MPH細胞內脂質沉積作用。結果見圖2和圖3。

圖2 廣藿香醇對OA+PA誘導細胞內紅色脂滴聚集的影響（油紅O染色，200×）Figure 2 Patchoulialcohol decreased OA+PA?induced lipid accumulation in MPH cells（200×）

圖3 廣藿香醇對OA+PA誘導細胞內TG含量的影響Figure 3 Patchouli alcohol reduced OA+PA?induced TG level in MPH cells(±s，n=3)

3.3 廣藿香醇對OA+PA誘導MPH細胞ROS形成的影響

結果見圖4。與對照組比較，模型組中MPH細胞內DCFH?DA熒光探針水平明顯增加，表明OA+PA誘導的細胞內ROS形成。與模型組比較，廣藿香醇中、高劑量組均可明顯降低細胞內DCFH?DA熒光探針水平。結果表明，廣藿香醇可顯著降低OA+PA誘導的MPH細胞內ROS形成作用。

圖4 廣藿香醇對OA+PA誘導細胞內紅色脂滴聚集的影響Figure 4 Patchoulialcohol mitigated OA+PA?induced ROSgeneration in MPH cells（200×）

3.4 廣藿香醇對OA+PA誘導MPH細胞FXR信號和脂質合成相關基因mRNA表達的影響

結果見圖5。與對照組比較，模型組細胞內FXR、SHP和BSEP的mRNA表達顯著降低，而脂質合成基因FASN、CD36和FABP1的mRNA表達則明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，廣藿香醇中、高劑量組可顯著提高OA+PA誘導MPH細胞內FXR信號（FXR、SHP和BSEP）的mRNA表達，而抑制脂質合成基因（FASN、CD36和FABP1）的mRNA表達，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結果表明，廣藿香醇可提高FXR信號，進而抑制OA+PA誘導的細胞內脂質合成作用。

圖5 廣藿香醇對OA+PA誘導MPH細胞內FXR信號和脂質合成相關基因的mRNA表達水平的影響Figure 5 Effect of patchouli alcohol on the mRNA expression level of FXR signaling and lipid synthesis genes in MPH cells induced by OA+PA(±s，n=3)

3.5 FXR敲除后，廣藿香醇對OA+PA誘導FXR敲除MPH細胞脂質水平積蓄作用的影響

為了進一步闡述廣藿香醇激動FXR信號在降脂、抗NAFLD作用中的重要性，本研究進行分離FXR基因敲除小鼠的MPH細胞。在野生型MPH中，與模型組比較，廣藿香醇高劑量組明顯降低細胞內紅色脂滴聚集和細胞內TG水平，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；相反，在FXR敲除MPH中，與模型組比較，廣藿香醇介導的細胞內脂滴積蓄和TG水平的降低作用則受到損害，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果表明，廣藿香醇降低OA+PA誘導MPH細胞內脂質沉積作用依賴于FXR的激動作用。結果見圖6和7。

圖6 FXR敲除后，廣藿香醇對OA+PA誘導細胞內紅色脂滴聚集的影響Figure 6 FXR deletion compromised patchouli alcohol?mediated the decrease of lipid accumulation induced by OA+PA in MPH knockout cells（200×）

3.6 FXR敲除后，廣藿香醇對OA+PA誘導FXR敲除MPH脂質合成相關基因的影響

圖7 FXR敲除后，廣藿香醇對OA+PA誘導FXR敲除MPH細胞內TG含量的影響Figure 7 Effect of patchouli alcohol on TG level in FXR?deficient MPH cells induced by OA+PA(±s,n=3)

結果見圖8。在野生型MPH中，與模型組比較，廣藿香醇明顯提高FXR信號FXR、SHP和BSEP的mRNA表達，而抑制OA+PA誘導的脂質合成基因FASN、CD36和FABP1的mRNA表達，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；相反，在FXR敲除MPH中，與模型組比較，廣藿香醇失去了脂質合成基因的抑制作用，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果表明，廣藿香醇降低OA+PA誘導的MPH細胞內脂質合成基因的調控作用依賴于FXR的激動作用。

圖8 FXR敲除后，廣藿香醇對OA+PA誘導FXR敲除MPH細胞內脂質合成基因mRNA表達水平的影響Figure 8 The effect of patchouli alcohol on mRNA expression level of lipid synthesis genes in FXR?knockout MPH cells induced by OA+PA(±s，n=3)

4 討論

隨著肥胖及相關代謝綜合征全球化流行的趨勢下，我國NAFLD發病率逐年升高，已成為最常見的肝臟疾病之一。NAFLD患者肝細胞內的脂質代謝障礙，致肝細胞脂質沉積，造成肝內脂肪變性、ROS形成，繼而發生肝細胞炎癥、胰島素抵抗等，最終導致肝纖維化、肝硬化的發生、發展。到目前為止，NAFLD發病機制還未完全清楚，臨床上也缺乏有效的治療藥物和措施。因此，該病嚴重威脅人們的健康，故開發研制針對NAFLD有效藥物具有必要性及緊迫性。

NAFLD致脂質吸收增加，引起TG形成升高，而致肝脂肪變性，進而損害肝臟功能[10]，因此，降低肝臟脂質含量的策略可能成為防治NAFLD的重要措施[10?11]。脂質合成/吸收紊亂主要由于肝臟核受體（如FXR、PPARα、LXR等）的功能紊亂，從而失去對參與肝細胞脂質的合成/吸收等相關基因（合成基因FASN、SCD1、CD36、ACC、FATP1等）的作用調控[12?14]，導致肝臟脂質合成/吸收紊亂。FASN是脂肪酸合成的關鍵限速酶，其活性或基因表達的增加可促進脂質合成，抑制FASN的表達則顯著降低肝臟脂質沉積，發揮改善NAFLD作用。研究顯示NAFLD患者體內FXR和BSEP基因表達降低，且FXR敲除小鼠，引起脂質合成基因FASN、SCD1、ACC等表達升高，易于發生脂質紊亂，表明FXR是防治NAFLD一個重要靶點[15?16]。相反，激動肝臟FXR，進而抑制FASN表達，可逆轉高脂飲食誘導肝脂滴聚集和大泡性脂肪變性特征，發揮抗NAFLD作用[17?18]，表明FXR激動劑在防治NAFLD中意義重大。然而，目前臨床上涉及靶向FXR防治NAFLD的藥物僅限于OCA[19]。因此，開發低毒、有效的FXR激動劑迫在眉睫。

藿樸夏苓湯組方源自《醫原》，方由廣藿香、厚樸（姜制）、半夏（制）、茯苓、杏仁、薏苡仁、白蔻仁、淡豆豉、澤瀉和通草組成，具有“理氣化濕、疏表和中”之功效，臨床用于濕溫初起，濕重于熱者，是臨床常用治濕之良劑，臨床和實驗研究顯示良好的保肝、降脂、抗NAFLD作用[3?8]，但抗NAFLD藥理機制和物質基礎不明。

考慮到FXR信號在NAFLD發病的重要性，本實驗首先通過對方中的代表性成分如廣藿香醇（廣藿香的主要成分）、厚樸酚、和厚樸酚（厚樸的主要成分）、乙酰澤瀉醇A/B（澤瀉的主要成分）、茯苓酸（茯苓的主要成分）、苦杏仁苷（杏仁的主要成分）、琥珀酸（半夏的主要成分）、甘油三油酸酯（薏苡仁的主要成分）等，進行熒光素酶報告基因活性分析，篩選FXR激動劑。與Meng和Lin等報道一致[20?21]，本研究結果顯示，廣藿香醇和乙酰澤瀉醇A/B升高BSEP?luc熒光素酶報告基因活性，提高FXR蛋白表達和促進FXR入核作用，加強FXR信號的mRNA表達，并抑制脂質合成基因的表達，最終導致降低了OA+PA誘導MPH細胞內脂質堆積和ROS形成。FXR敲除實驗顯示，FXR敲除后，廣藿香醇失去了對FXR信號的誘導作用，導致了損害廣藿香醇改善OA+PA誘導脂質合成基因的抑制作用和改善MPH細胞脂質沉積作用。本實驗結果驗證了廣藿香醇降脂作用主要是依賴于FXR的激動作用。

綜上所述，本實驗在MPH細胞水平上顯示藿樸夏苓湯成分廣藿香醇通過激動FXR信號通路，抑制脂質合成基因的表達，進而改善OA+PA誘導的MPH細胞脂質堆積和ROS形成的作用。