牛多殺巴氏桿菌的生物學特性研究

傅偉文

（合浦縣畜牧技術推廣中心 536199）

多殺巴氏桿菌是一種革蘭氏陰性菌，能感染家禽、豬、牛、羊等多種動物，其中，牛、羊感染多殺巴氏桿菌通常表現為出血性敗血癥，家禽感染可引起禽霍亂，豬感染可引起豬肺疫，成為危害畜牧行業的病原之一[1]。本研究以廣西某養殖場出現呼吸道癥狀的病牛為研究對象，采集肺臟組織，采用細菌的分離培養、多殺性巴氏桿菌特異性基因kmt擴增、血清型擴增鑒定、毒力基因（轉鐵蛋白tbpA、編碼4型菌毛基因ptfA、血紅色獲得受體hasR、脂蛋白plpE、外膜蛋白ompH）的擴增、藥敏試驗、致病性試驗等方法對細菌特性進行研究，旨在了解該牛呼吸道病例病原種類的確定及病原的致病機理，為該病的防控、疫苗的研制奠定基礎。

1 材料

1.1 病料樣品

2021年7月，病料來源于廣西某養牛場送檢的肺臟組織。據主訴，該病例臨床癥狀表現為咳嗽、流鼻涕；剖檢發現肺出血、水腫；腸道黏膜充血等癥狀。

1.2 試驗動物

6～8周齡、體重為22g左右的健康昆明鼠10只，購自廣西中醫藥大學。

1.3 試劑及儀器

PCR儀、凝膠成像系統，購自Bio-rad公司；細菌DNA提取試劑盒、2×Taq MasterMix等，均購自北京康為世紀生物技術有限公司；藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.4 引物合成

特異性基因kmt引物、5種莢膜血清型引物（A/B/D/E/F型）、5種毒力相關基因（tbpA、ptfA、hasR、plpE、ompH）引物參照吳翠蘭、馬曉菁、何傳雨等文獻[2-4]的引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 方法

2.1 細菌分離與培養

無菌采取病料組織劃線接種于血平板瓊脂培養基上，37℃培養24～48h觀察，記錄情況。挑取單個菌落進行革蘭氏染色，鏡檢。

2.2 分離菌PCR擴增

用細菌基因組DNA試劑盒提取分離株基因組DNA，以該DNA為模板，用多殺巴氏桿菌特異性基因kmt引物、5種莢膜血清型引物（A/B/D/E/F型）、5種毒力相關基因（tbpA、ptfA、hasR、plpE、ompH）進行PCR擴增鑒定。擴增程序為：95℃預變性5min；然后進行30個循環95℃變性1min、50℃～60℃退火1min、72℃延伸1min 30s；最后再進行72℃延伸10min。擴增結束后，取7μL的PCR產物在1.5%的凝膠瓊脂糖上進行電泳，觀察電泳結果。

2.3 分離株的藥敏試驗

選取多粘菌素、頭孢拉定、新霉素、四環素、氧氟沙星、環丙沙星、氟苯尼考、頭孢曲松、強力霉素、慶大霉素、阿奇霉素、頭孢氨芐、頭孢噻肟、青霉素等14種藥物進行測定分離株的耐藥情況。

2.4 分離株的致病性試驗

在無菌的操作下，5只試驗組小鼠按劑量為0.2mL/只腹腔注射純培養菌，另5只對照組則按劑量為0.2mL/只腹腔注射生理鹽水。觀察記錄小鼠的精神狀態和死亡時間等。

3 結果

3.1 細菌分離與培養結果

將肺病料接種于血瓊脂平板置于37℃培養24～48h后，平板上生長有露珠樣、透明、不溶血中等大小的菌落，挑取單個菌落革蘭氏染色鏡檢可觀察到革蘭氏陰性短桿菌。

3.2 分離菌PCR擴增

將多殺巴氏桿菌特異性基因kmt引物進行PCR擴增、電泳后，結果顯示，可擴出目的條帶大小為456 bp的基因片段（圖1），說明該分離株為多殺巴氏桿菌。

用5種莢膜血清型引物（A/B/D/E/F型）進行PCR擴增鑒定莢膜血清型，結果顯示，只有A型能擴增出條帶大小為1048 bp片段（圖1）。

用5種毒力相關基因（tbpA、ptfA、hasR、plpE、ompH）進行PCR擴增鑒定，結果顯示只有ptfA、plpE、ompH毒力基因擴增出與之相符的目的條帶，目的條帶大小分別為488 bp、1000 bp、438 bp（圖1）。對目的條帶進行切膠、回收、連接、轉化、測序，測序結果經BLAST驗證，該分離株含有ptfA、plpE、ompH這3個毒力基因。

圖1 PCR結果

3.3 分離株的藥敏試驗結果

藥敏結果檢測顯示，該分離株對頭孢噻肟、頭孢曲松、氧氟沙星、環丙沙星等敏感，對頭孢氨芐、頭孢拉定、強力霉素、慶大霉素等中敏；對多粘菌素、新霉素、四環素、氟苯尼考、阿奇霉素、青霉素耐藥，見表1。

表1 藥敏試驗結果

3.4 分離株的致病性試驗

試驗組小鼠在接種后3h開始出現精神沉郁、運動減少；接種6h后小鼠運動遲鈍；接種24h內小鼠全部死亡。剖開發現肺臟、脾臟腫大、出血，并從中分離到革蘭氏陰性菌，經PCR驗證，該菌與所注射的菌一致。而對照小鼠連續觀察5d，未發現異常。結果表明，該分離株具有很強的致病性。

4 討論

多殺巴氏桿菌是一種條件性致病菌，廣泛存在于動物上呼吸道黏膜，當動物機體抵抗力水平下降，易導致病原體的侵入，進而使動物致病。根據莢膜血清型可將多殺巴氏桿菌分為5個血清型，即A、B、D、E、F型，不同的莢膜血清型引發的臨床癥狀有所不同[5]。經過PCR驗證，本次研究從牛肺中分離出1株A型多殺巴氏桿菌，符合國內多地報道的牛源多殺巴氏桿菌流行血清型[6-9]。

藥物敏感性試驗結果顯示，該A型多殺巴氏桿菌分離株對頭孢噻肟、頭孢曲松、氧氟沙星、環丙沙星等敏感，對頭孢氨芐、頭孢拉定、強力霉素、慶大霉素等中敏；對多粘菌素、新霉素、四環素、氟苯尼考、阿奇霉素、青霉素耐藥。結果表明，該分離株存在耐藥性。吳同壘[10]對河北分離株進行藥敏試驗，結果顯示，分離株對大多數藥物敏感，但對復方新諾明、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和林可霉素耐藥較高，達到80%以上。杜英立等[6]對廣西株進行藥敏試驗，結果顯示，分離株對阿米卡星、卡那霉素、諾氟沙星敏感，對氟苯尼考、丁胺卡那、頭孢曲松、慶大霉素、四環素中敏，對鏈霉素、紅霉素、環丙沙星、青霉素耐藥。由此可見，不同地區分離的菌株，細菌的耐藥程度有所差異，因此，應在藥敏試驗結果的指導下合理用藥，避免盲目用藥。

本研究還對該分離株進行致病性試驗，結果表明，該A型多殺巴氏桿菌廣西分離株具有很強的致病性。多殺巴氏桿菌的毒力因子很多，例如黏附素相關因子在細菌黏附等方面具有非常重要的作用；莢膜多糖，具有抗吞噬、抗溶菌酶等作用；外膜蛋白在菌體對宿主感染和致病過程中起著非常重要的作用[4]。本研究對5種毒力基因tbpA、ptfA、hasR、plpE、ompH進行檢測，結果顯示ptfA、plpE、ompH這3個基因能檢測出來，這些結果與馬曉菁[3]、何傳雨[4]等報道一致。Ewers等報道86.9%的多殺巴氏桿菌中隱含黏附有關的基因ptfA等[11]。ptfA菌毛是革蘭氏陰性菌黏附宿主上皮組織細胞表面的重要毒力因子，具有黏附作用，其表達的蛋白質的免疫厡性已被證實，該基因的研究成為研究多殺巴氏桿菌的熱點基因。plpE為多殺巴氏桿菌脂蛋白E，該蛋白具有高度的免疫厡性。ompH是多殺巴氏桿菌的外膜蛋白中的孔蛋白，作為研制疫苗的一種抗原蛋白[12]。目前我國預防的多殺巴氏桿菌苗主要是B型滅活疫苗，而目前國內頻繁發生的主要是A型流行株，各血清型之間的交叉保護低，對多殺巴氏桿菌毒力因子研究為研制疫苗奠定基礎。

參看文獻

[1] 魏詩謠， 王麗揚， 張信軍， 等.3株羊源D型多殺性巴氏桿菌的生物學特性研究[J].揚州大學學報(農業與生命科學版)， 2021， 42(4): 12-17.

[2] 吳翠蘭， 劉琰， 李軍， 等. D型多殺性巴氏桿菌和綿羊肺炎支原體引起山羊的混合感染[J].動物醫學進展， 2020， 41(3):57-61.

[3] 馬曉菁. 致犢牛肺炎多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及部分生物學特性研究[D].石河子:石河子大學， 2010.

[4] 何傳雨. 牛源多殺性巴氏桿菌莢膜和毒力相關基因的克隆及序列分析[D].石河子:石河子大學， 2011.

[5] 王喜， 元正菊， 張信艷， 等.雞源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及生物學特性分析[J].中國獸醫科學， 2021，51(11)：1411-1419..

[6] 杜英立， 吳翠蘭， 陸震， 等.牛A型多殺巴氏桿菌的分離鑒定[J].今日畜牧獸醫， 2021， 37(6): 5-6.

[7] 何泊寧， 周金玲， 赫鳴睿， 等.牛源A型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及毒力基因檢測[J].中國獸醫科學， 2019， 49(8):1042-1047.

[8] 張貴剛， 徐麗媛， 黃海碧， 等.一株肉牛A型多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定[J].中國動物傳染病學報， 2019， 27(5): 86-90.

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[10] 吳同壘， 于秀建， 李巧玲， 等.肉牛多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及藥敏分析[J].中國獸醫學報， 2019， 39(9): 1728-1734.

[11] Ewers C ， Antina Lübke-Becker， Bethe A ， et al.. Virulence genotype of Pasteurella multocida strains isolated from different hosts with various disease status[J]. Vet Microbiol， 2006， 114(3-4):304-317.

[12] 蔡廣強.多殺性巴氏桿菌毒力因子研究進展[J].上海畜牧獸醫通訊， 2013(6): 7-9.