基于SSR標記的鲌魴“先鋒2號”、團頭魴及黑尾近紅鲌的群體遺傳分析

孫艷紅，馬 浩，魏輝杰，王貴英，陳 見，祝東梅，李 佩，李 清

(1.武漢市農業科學院水產研究所，武漢 430207；2.華中農業大學，武漢 430070;3.武漢先鋒水產科技有限公司，武漢 430207)

魴、鲌均隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鲌亞科(Cultrinae)。團頭魴()是魴類中重要的組成部分，是我國重要的淡水經濟魚類，廣泛分布于各流域湖泊，因其食性廣、易捕撈、生長快、肉質細嫩而深受喜愛；黑尾近紅鲌()是長江上游特有經濟魚類，其人工養殖成本低、性情溫馴、易捕撈、易活魚上市。本研究科研團隊將經選育的體型好、生長快的4代的團頭魴(♀)與經選育的4代的抗應激、反應溫順黑尾近紅鲌()進行雜交，再經過4代以上的選育獲得了體型與團頭魴相近，生長快、抗應激能力強的鲌魴“先鋒2號”，已于2019年被全國水產原良種委員會審定為新品種。ZHU等已經報道過鲌魴“先鋒2號”的線粒體序列，但是對于親本和子代之間的親緣關系以及遺傳多樣性分析還未見報道。

遺傳多樣性是種群或者群體長期生存和發展中遺傳變異的直接體現，因此探究魚類的遺傳多樣性可以為魚類的育種工作提供相應的理論指導。微衛星(microsatellite)也稱簡單重復序列(simple sequence repeats,SSRs)，由串聯排列的1～6 bp簡單序列重復組成，是廣泛分布在真核生物基因組中的一種中度重復序列。目前為止，微衛星標記由于具有高突變率、共顯性、在基因組中廣泛均勻分布、穩定易檢測等優點大多被應用到魚類群體遺傳的研究和遺傳圖譜繪制。在魚類雜交后代的遺傳分析中也都普遍使用微衛星技術，已有學者對黃顙魚()(♀)×瓦氏黃顙魚()()、尼羅羅非魚()(♀)×薩羅羅非魚()()、團頭魴(♀)×翹嘴鲌()()等進行親本與子代的分析。

本實驗利用篩選的11個微衛星位點對鲌魴“先鋒2號”、團頭魴及黑尾近紅鲌群體的遺傳特性以及親緣關系進行了分析，旨在為鲌亞科魚類的合理開發利用、下一步的選育工作以及種質資源保護提供一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

團頭魴群體引自湖北省梁子湖野生群體，黑尾近紅鲌群體引自長江上游野生群體，兩者均經過了武漢市農科院水產所和武漢先鋒水產科技有限公司(先鋒公司)4代選育，將選育的團頭魴(♀)與選育的黑尾近紅鲌()進行雜交，再經過4代選育獲得了體型與團頭魴相近，生長快、抗應激能力強且在肉質方面上具有優勢的鲌魴“先鋒2號”。三個群體均在先鋒公司基地進行人工養殖。三個群體各取30尾，分別剪尾鰭保存于無水乙醇中，帶回實驗室于4 ℃冰箱中備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測

使用酚氯仿分別提取鲌魴“先鋒2號”、團頭魴、黑尾近紅鲌三個群體共90個樣本的DNA。基因組DNA質量通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用紫外分光光度計進行DNA濃度與純度的檢測，合格后稀釋至100 ng/μL，置于-20 ℃保存備用。

1.2.2 熒光標記的微衛星引物

根據SUN等發表的黑尾近紅鲌微衛星引物，從90尾樣本中隨機挑選5尾團頭魴、5尾鲌魴“先鋒2號”、5尾黑尾近紅鲌的基因組DNA為模板，PCR擴增后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，聚丙烯凝膠電泳檢測后銀染，篩選出多態性好以及能夠穩定擴增的引物，用于三個群體的遺傳分析。

表1 微衛星熒光引物和位點特征

1.2.3 PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳檢測及SSR分型

通過PCR擴增使11對熒光引物在鲌魴“先鋒2號”、團頭魴、黑尾近紅鲌三個群體總共90個樣本中進行擴增，PCR反應總體系20 μL，包括Premix TagVersion 2.0 (Takara) 10 μL，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1.5 μL，ddHO 6.5 μL。PCR擴增：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增后的產物經過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其存在性后送由上海生工生物工程有限公司用ABI PRISM 3730測序儀進行等位基因分型。

1.2.4 數據分析

采用Genemarker錄入每個微衛星位點各個個體的等位基因數據；Popgene v1.32和Cervus v3.03計算了每個位點的平均等位基因數(number of alleles,)、有效等位基因數目(number of effective alleles,)、觀測雜合度(Observed heterozygosit,)、期望雜合度(Expected_heterozygosity,)、多態性信息含量(Polymorphysm_information_content,)和Nei’s遺傳距離；Convert131進行轉換格式類型。采用軟件Poptree V2和MEGA X建立群體遺傳關系的聚類樹；PCoA-GenALEx v6.5基于遺傳距離來分析群體間的遺傳關系。

2 結果分析

2.1 微衛星多態性引物的篩選

對所選46對微衛星引物進行篩選工作，初步篩選出11對符合預期的微衛星引物，按照其擴增片段的大小進行組合，組合內進行三種熒光染料(6-FAM,HEX,ROX)分別標記，熒光標記引物見表1，熒光引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

2.2 遺傳多樣性分析

將11對引物在鲌魴“先鋒2號”、團頭魴、黑尾近紅鲌三個群體分別進行擴增情況統計分析(表2)。結果顯示，團頭魴群體的在2～6之間，平均為4.182，在1.133～3.122之間，平均為2.482，在0.063～1.000之間，在0.121～0.733之間，值為0.508，6個位點極顯著或顯著偏離哈迪-溫伯格平衡；鲌魴“先鋒2號”群體在2～8之間，平均為4.273，在1.827～6.564之間，平均為3.080，在0.067～0.867之間，在0.471～0.875之間，值為0.572，1個位點顯著偏離哈迪-溫伯格平衡；黑尾近紅鲌群體在2～15之間，平均為4.273，在1.210～11.842之間，平均為2.803，在0.063～0.933之間，在0.179～0.947之間，值為0.414，2個位點顯著偏離哈迪-溫伯格平衡。三個群體共90個個體在11個微衛星位點上共擴增出81個等位基因。其中在3～20的范圍內，的范圍為2.084～9.400，均值分別是7.364和3.862。的在0.188～0.830之間，均值為0.537。的在0.528～0.930之間，均值為0.696。在群體水平上進行統計分析，11個位點在三個群體中的多態百分比均為100%。黑尾近紅鲌群體的,和三項指標均小于其他兩個群體。

表2 三種魚11個微衛星位點的遺傳多樣性參數

2.3 群體間的遺傳距離與遺傳相似度

三個群體間Nei的遺傳相似度和遺傳距離見表3。鲌魴“先鋒2號”和團頭魴的遺傳相似度(0.762 7)高于鲌魴“先鋒2號”和黑尾近紅鲌的遺傳相似度(0.583 8)。鲌魴“先鋒2號”和團頭魴的遺傳距離(0.270 9)小于鲌魴“先鋒2號”和黑尾近紅鲌的遺傳距離(0.538 1)，表明雜交鲌魴“先鋒2號”與母本團頭魴的親緣關系更近，遺傳上更偏向于母本，這與雜交選育過程中表現出來的形態學分析結果相一致，表明團頭魴對雜交子代的貢獻率大于父本黑尾近紅鲌。

表3 三種魚間Nei的遺傳相似度(對角線上)和遺傳距離(對角線下)

2.4 群體間的遺傳結構與親緣關系

2.4.1 聚類分析

基于遺傳距離運用UPGMA法對三個群體進行聚類分析(圖1)。結果表明，黑尾近紅鲌群體與其他兩個群體分離，單獨形成一支，團頭魴群體和鲌魴“先鋒2號”群體兩個群體聚成一支。

圖1 基于遺傳距離建立的UPGMA聚類樹

2.4.2 分子變異分析

通過對三個群體的AMOVA分析結果表明，種群間的遺傳變異占27.09%，種群內的遺傳變異占72.91%(表4)。群體內的遺傳變異大于群體間，總體上整個群體發生了顯著的遺傳分化[遺傳固定系數(st)=0.271，<0.000 1]。

表4 三個群體的分子方差變異分析

2.4.3 PCoA主坐標分析

基于個體間遺傳距離對三個群體90個個體進行PCoA主坐標分析(圖2)，可以明顯發現團頭魴群體與鲌魴“先鋒2號”群體更為相似聚集在一起，而黑尾近紅鲌群體中個體相距較遠而單獨聚類。

圖2 3個群體基于個體間遺傳距離的PCoA主坐標分析Fig.2 Principal coordinate analysis (PCoA) of pairwise distances between individuals of three populationsTTF：團頭魴；XF2：鲌魴“先鋒2號”；HW：黑尾近紅鲌

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性分析

研究表明，微衛星側翼序列在親緣關系較近的群體間相對保守，同時有部分微衛星在親緣關系較遠的分類群體間也具有一定的保守性，因此使得SSR分子標記具有較高的通用性，可在不同種群之間快速、有效地擴增，且群體間親緣關系越近，跨種擴增的可能性越強。基于此原理，大黃魚、鯉、鱘魚和團頭魴的微衛星引物都能在近緣物種中有效擴增，并應用于遺傳分析研究。在本研究中，在黑尾近紅鲌基因組和轉錄組中開發的11對中高多態性的微衛星引物在不同種的鲌魴“先鋒2號”與團頭魴群體中均能進行有效擴增，但是在團頭魴群體中偏離哈迪-溫伯格平衡的位點數較多，可能與非同源跨種應用，等位基因數偏少有關。

目前，國內關于魴屬和鲌屬的育種工作主要集中在選擇育種和雜交育種兩個方面。群體的遺傳多樣性能體現出物種是否能夠較快適應環境、維持生命并產生突變進化的能力，其主要表現在有效等位基因數的豐富和均勻程度、遺傳雜合度的大小和多態信息含量3個方面。等位基因越多，遺傳雜合度數值越大，多態信息含量數值越高，則證明群體遺傳變異越高，更能適應自然環境變化。雜交后代的等位基因和雜合度一般都高于雙親，這也是形成雜種優勢的重要遺傳物質基礎之一。本研究中通過11對微衛星引物檢測到鲌魴“先鋒2號”的平均有效等位基因(3.080)大于母本團頭魴(2.482)與父本黑尾近紅鲌(2.803)，鲌魴“先鋒2號”的平均觀測雜合度(0.507)小于母本團頭魴(0.712)大于父本黑尾近紅鲌(0.380)，鲌魴“先鋒2號”的多態信息含量(0.572)均高于父本黑尾近紅鲌(0.414)與母本團頭魴(0.508)，多態信息含量大于5時為高度多態，表明雜交鲌魴“先鋒2號”的遺傳變異程度較團頭魴、黑尾近紅鲌群體高，更能適應自然環境的變化，更易存活。這些研究結果同以往許多研究報道都有一致性，如李景芬等研究黃顙魚(♀)×瓦氏黃顙魚()得出的雜種一代基因變異程度比雙親高，DNA多態性豐富。王宏玉等研究的黃顙魚(♀)×長吻鮠()雜交子代多態性信息含量、雜合度以及等位基因數均比雙親高。這些研究結果都體現出雜交子代較雙親的遺傳多樣性有所增加，具有一定的雜交優勢,有較大的培育潛力。

3.2 親緣關系分析

遺傳距離與遺傳相似度常用于群體的親緣關系分析。雜交親本間遺傳差異越大，親緣關系越遠，其后代雜種優勢越明顯。李思發等基于SSR標記對五種羅非魚群體進行了遺傳距離分析，構建的NJ聚類樹以及UPGMA聚類樹，結果表明，其中兩個雜交種在遺傳上與母本遺傳距離較近；王俊基于SSR標記對哲羅鮭()、細鱗鮭()及雜交子一代進行親緣關系分析，結果表明子一代與母本細鱗鮭的遺傳距離(0.315 0)小于子一代與父本哲羅鮭之間的遺傳距離(0.395 3)，同時與母本的遺傳相似系數(0.729 8)大于父本(0.673 5)，子一代與母本親緣關系更近；朱樹人開發10對微衛星引物對烏鱧()、斑鱧()及雜交F1的進行了群體遺傳多樣性分析，并利用三種魚之間的遺傳距離進行了聚類分析，發現雜交F1的遺傳特性偏向母本斑鱧。而王宏玉等研究的黃顙魚(♀)×長吻鮠()雜交子代與父本的親緣關系和遺傳距離更近，以及陳見等研究的翹嘴鲌(♀)與黑尾近紅鲌()雜交子代也是與父本遺傳差異小于與母本的遺傳差異，與父本的親緣關系較近。這些研究結果均表明雜交雙親的遺傳物質對子代的貢獻存在不對等現象。

本研究采用NJ聚類以及PCoA主坐標分析來探討團頭魴、鲌魴“先鋒2號”、黑尾近紅鲌三種魚之間的遺傳親緣關系。從NJ聚類分析能明顯看出鲌魴“先鋒2號”與母本團頭魴具有更近的親緣關系，而與父本黑尾近紅鲌相距較遠。從PCoA主坐標分析方面表明鲌魴“先鋒2號”各個個體之間與團頭魴各個個體之間具有較小的遺傳差異。這與雜交選育過程中表現出來的形態分析研究結果一致，表明團頭魴對雜交子代的貢獻率大于黑尾近紅鲌。

以上結果可能由于在選育過程中，雜交子代的選擇以形態學上接近母本團頭魴的個體為主，因此遺傳上，鲌魴“先鋒2號”更接近母本團頭魴，與父本黑尾近紅鲌相距較遠。一般情況下，在魚類進行雜交時，異源精子可能只對卵子起到刺激作用，父本有部分遺傳物質可能向子代傳遞。同時，人工操作和環境因素對基因交流、親本向子代傳遞遺傳物質的過程都會產生影響。雖然鲌魴“先鋒2號”更偏向于母本，但同時也具備了父本黑尾近紅鲌的遺傳物質，因此后代較雙親更有優勢。通過養殖對比試驗發現其生長速度與團頭魴接近，但在起捕率和耐運輸方面優于團頭魴