龜鱉廢水處理系統中細菌群落組成及動態變化

高 娜，楊 坤，方 婷，梁陽陽，崔 凱，盧文軒

(安徽省農業科學院水產研究所水產增養殖安徽省重點實驗室，合肥 230000)

隨著長江流域重點水域全面禁捕方案的實施，重點湖泊、水庫等大型水域退出漁業生產功能，漁業生產空間大幅壓縮，池塘水域成為漁業發展的主戰場。與此同時，水產養殖業的綠色發展對池塘養殖環境治理提出了更高要求。研發經濟高效的養殖廢水處理工藝成為養殖企業和環保行業的熱點問題。目前已開發出包括活性污泥法、生物接觸氧化法、序批式反應器(SBR)，移動床生物膜反應器(MBBR)等多種處理工藝。微生物是污水處理系統中污染物去除的主體，系統的穩定運行和處理效果與其中的微生物群落結構及功能密切相關。因此，研究養殖廢水處理系統中各模塊的微生物群落組成、明確占主導地位的微生物群落以及微生物群落與污染物濃度之間的關聯性,對優化廢水處理系統的菌群結構，提高水質凈化效率具有重要作用。

污水生物處理系統的性能和穩定性與微生物群落結構和動態密切相關。為了解廢水處理系統中各單元的凈水機制，掌握優化系統運行參數的基礎數據，為養殖廢水高效凈化提供一定的技術支持，本研究運用高通量測序技術對采用水解酸化+A/O工藝的龜鱉廢水處理系統中的微生物群落結構進行分析，通過相關性分析對環境因子和微生物群落的變化進行分析，探索對污染物質降解起重要作用的功能微生物。

1 材料與方法

1.1 龜鱉養殖廢水處理工藝流程

選擇安徽省銅陵市順東農業科技有限公司龜鱉產業園為研究對象，主養品種中華鱉，餌料為機制飼料(主要成分為40%粗蛋白、4.5%粗脂肪、12%水分、粗纖維5%、粗灰分16%)結合植物性蛋白(胡蘿卜、番茄等)，日常養殖過程中池水不外排，僅在商品鱉出售時才清池排水。龜鱉廢水處理工藝流程見圖1，養殖周期結束后，集中排放的養殖尾水經過人工格柵攔截掉廢水中的大顆粒物，進入水解酸化池，使大分子難降解的物質分解為小分子易降解物質。出水進入厭氧池進一步水解酸化去除化學需氧量(COD)。厭氧發酵后的廢水進入好氧池，通過不斷地曝氣使微生物進行有氧呼吸從而去除其中的污染物。經過曝氣處理的污水依次通過初沉池和二沉池，最后進入生態濕地進行深度凈化，最終出水達標排放。

圖1 龜鱉養殖廢水處理工藝流程

1.2 水樣采集

依據系統的運行情況，于2020年4月14日進行樣品采集，共采集18個水樣，其中在龜鱉養殖溫室(WS)、水解酸化池(CC)、厭氧池(YY)、好氧池(HY)、初沉池(CS)、二沉池(SC)各取3個重復樣。每個點取500 mL廢水裝入無菌PV瓶，低溫條件下保存運輸至實驗室進行后續分析。

1.3 水質檢測

1.4 微生物菌群分析

各樣點采集的水樣經0.22 μm的微孔濾膜過濾，將富集了微生物菌體的濾膜送至美吉生物醫藥科技有限公司完成DNA提取，PCR擴增，文庫構建，上機測序，高通量數據處理等工作。

1.5 數據統計分析

運用EXCEL軟件統計平均數和標準方差，使用UPARSE軟件，根據97%的相似度對序列進行OTU聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP對每條序列進行物種分類注釋，利用QIIME軟件計算樣品包括Chao1指數和Shannon指數的Alpha多樣性值。運用person相關系數計算物種與環境因子之間的相關性。

2 結果

2.1 水體理化性質

表1 各處理單元水質指標分析

2.2 樣品的OTUs和多樣性分析

表2顯示所有樣本的覆蓋度均高于99%，表明測序結果覆蓋度較好且具有很高的可信度，能夠代表樣本的真實情況。對所有樣品的有效序列進行聚類，以97%的相似性將序列聚類成一個OTU。維恩圖可以比較直觀地表現樣品中的OTU數目組成相似性及重疊情況，18個樣品中共有的OTU數目為111，不同樣品中特有OTU表現為養殖溫室295個、水解酸化池116個、厭氧池78個、好氧池46個、初沉池20個、二沉池27個(圖2)。α多樣性分析結果顯示(表2)，不同處理單元廢水中的微生物群落的豐富度指數(ACE和Chao l)和多樣性指數(Shannon和Simpson)均存在一定的差異。

圖2 OTUs韋恩圖

表2 微生物群落多樣性指數

2.3 不同處理單元水體中細菌群落結構特征與動態變化

各單元水體中共檢測到42個門水平的細菌和一些無法歸類的細菌，所有樣本中豐度占比均小于0.05的物種歸為others(圖3)。由表2可知，養殖溫室水體中微生物多樣性水平較高，圖3顯示其中各類微生物占比較為平均。水解酸化池水體中優勢類群為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，占比率為49.56%、27.25%、5.88%。厭氧池中優勢類群發生了變化，主要為放線菌門(42.56%)、變形菌門(41.02%)和擬桿菌門(7.06%)。好氧池相對于厭氧池來說，優勢群體的種類沒有改變，除變形菌門(42.18%)外，其他種群數量明顯發生了變化，擬桿菌門(22.43%)顯著高于厭氧池，放線菌門(20.63%)顯著低于厭氧池。初沉池和二沉池中優勢類群依然為變形菌門、擬桿菌門和放線菌門，但是種群含量存在差異，二沉池中變形菌門處于絕對優勢地位，占比高達56.55%。

圖3 不同處理單元水體中細菌群落結構組成(門水平)

以屬為分類單元分析水體中的細菌群落結構，結果如圖4所示，龜鱉廢水處理系統中檢測到的細菌覆蓋了679個屬，大量的序列不能歸入已知屬(數據庫分別以科的名稱加-norank，-unclassified來表示)，所有樣本中豐度占比均小于0.05的物種歸為others。水體中細菌類群和含量隨著處理進程逐步發生改變。養殖溫室中細菌多樣性水平最高，但是豐度占比低于0.05的物種比例高達72.83%，其他優勢細菌屬為5.96%，分枝桿菌屬7.36%，norank-f-norank-o-Saccharimonadales 6.82%。在水解酸化池中，優勢細菌屬為噬氫菌屬35.62%，黃桿菌屬17.09%，地桿菌屬2.8%。進入厭氧池，優勢細菌屬發生了變化，變為尚未分類的微桿菌科(unclassified-f-Microbacteriaceae)18.77%，氣單胞菌屬14.87%，hgc1-clade 6.43%。好氧池中優勢細菌屬為腸桿菌屬14.67%，黃桿菌屬7.96%，hgc1-clade 6.43%；進入初沉池優勢細菌屬變為12.94%，不動桿菌屬8.91%，黃桿菌屬8.60%；二沉池優勢細菌屬為產卟啉桿菌屬13.99%，10.74%，尚未分類的紅桿菌科(unclassified-f-Rhodobacteraceae)9.71%。

圖4 不同處理單元水體中細菌群落結構組成(屬水平)

2.4 水質對龜鱉廢水處理系統中細菌群落結構的影響

表3 屬分類水平上細菌菌群與水質因子的相關性分析(分類水平總豐度前10的物種)

3 討論

有研究表明溫室龜鱉養殖在水產養殖模式中產生的污染最大，對環境的污染最嚴重，因此研究龜鱉養殖廢水處理工藝十分迫切。特定的微生物菌群能夠促進廢水處理系統中某些復雜大分子有機化合物的降解。本實驗龜鱉廢水處理系統采用水解酸化+A/O的工藝流程，溫室外排的廢水通過不同類型的功能池分級處理,不同類型功能池中微生物群落分布具有較大差異。多樣性分析結果中顯示好氧階段的細菌豐富度和群落多樣性比厭氧處理單元高，研究表明細菌豐富度和群落多樣性越高，污染物的去除效果越好。廢水經好氧單元處理后，細菌豐富度和多樣性明顯減少，可能是由于好氧階段消耗了廢水中大部分的營養物質，使得下游處理單元中的微生物生長受限。

大量關于污水處理系統中微生物的研究表明在不同的污水處理系統中的細菌群落主要以變形菌、綠彎菌、放線菌、厚壁菌和擬桿菌為功能菌群。在本研究中，變形菌門在各處理單元中都占有很大比例，研究表明變形菌門大部分屬于異養型細菌，是COD降解和脫氮過程的主要貢獻者，其中的β-變形菌綱更是與反硝化作用密切相關，擬桿菌門在污水處理中的作用僅次于變形菌門，研究資料表明該菌門有利于促進含氮物質的利用、類固醇生物轉化及水解大分子物質。以上分析表明，不同處理單元水體中優勢類群種類和含量均存在一定差異，這與翟一帆等在利用A2/O工藝處理養豬廢水中的研究一致。以屬分類水平討論處理系統中微生物群落組成發現，優勢細菌屬為黃桿菌屬、噬氫菌屬、尚未分類的微桿菌科、等。其中噬氫菌屬和黃桿菌屬是典型的反硝化菌屬，參與水體脫氮，也是城市污水及工業廢水處理活性污泥中優勢菌群。也與氮循環相關，可以使有機氮轉變成無機氮如硝酸鹽氮等。每一級處理單元中均有很多尚未得到分類鑒定的物種，有研究指出這些未分類或不能培養的功能性菌群的生長在維持水體氮平衡中起著至關重要的作用。綜上，在門和屬水平對微生物群落組成的研究發現不同的廢水處理階段優勢菌屬不盡相同，細菌群落在二沉池出水和溫室進水中存在明顯差異。在水解酸化池、厭氧池及好氧池樣品中存在大量特殊功能菌群，它們在該龜鱉廢水處理系統中，對污染物的分解和氮磷的去除發揮著重要作用。

4 結論

本研究采用高通量測序技術解析龜鱉廢水處理系統各處理單元的細菌群落結構，共檢測到42個細菌門，679個細菌屬。溫室中的優勢細菌和分枝桿菌屬是典型的致病菌，經過生物處理后，二沉池出水中致病菌顯著減量。黃桿菌屬、腸桿菌屬和氣單胞菌屬是常見的魚類致病菌，在前期處理進程中這些細菌占有一定的優勢地位，經過一系列生物處理進入二沉池后，它們的相對豐度大幅度下降，不影響廢水作為再生資源進入養殖池塘重新利用。各處理單元水質分析也表明，廢水經系統處理后符合污水綜合排放一級A標準(GB8978-1996)。綜上，采用水解酸化+A/O工藝處理可實現龜鱉養殖廢水的高效凈化和循環利用。該工藝相比于生態塘和人工濕地凈化既能減少用地，又能降低造價和運行費用，符合資源節約型、環境友好型社會的發展要求，對生物法處理規模化養殖廢水有一定的理論參考價值。