新疆黑槌蟲草羽束梗孢菌的液體深層發酵控制

張慧濤，王志方，侯新強

(新疆農業科學院 微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，新疆 烏魯木齊 830091)

新疆黑槌蟲草生長在新疆北疆阿爾泰山山區，分布于海拔1 250～2 000 m半陰半陽坡，是全年均可采收的新疆特色蟲草物種，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調節和腎臟保護性等生物活性[1]，但人工模擬新疆黑槌蟲草天然生長環境難度較大，難以獲得黑槌蟲草。我所從天然新疆黑槌蟲草菌核組織中分離培養出性狀優良且穩定的羽束梗孢菌株：CGMCC新槌12，并采用液體深層發酵方法生產新疆黑槌蟲草羽束梗孢菌菌絲體，然后再將發酵液制成菌粉和發酵濾液。發酵生產的羽束梗孢菌菌粉主要成分與天然黑槌蟲草基本相同，亦與青海產冬蟲夏草相當[2]。毒理和藥理研究表明，菌粉和發酵液安全無毒，濾清液與天然蟲草的浸出液一樣，味苦而純正，適合口服。

黑槌蟲草羽束梗孢菌發酵生產屬于菌種的純種培養過程,如果發酵過程中發現有其他微生物存在，就視為染菌。導致染菌的原因很多，均會導致發酵失敗。黑槌蟲草羽束梗孢菌發酵周期較長，在每級種子罐要生產7 d以上，逐級轉到最終發酵罐后則要發酵2周左右，如此長周期的發酵如果存在雜菌很容易造成發酵失敗。經過多批次的發酵，我們總結了羽束梗孢菌的發酵控制技術，將黑槌蟲草發酵成功率從最初不到50 %提高到目前的90 %以上。筆者從發酵的配套裝備和發酵過程控制方面分析黑槌蟲草羽束梗孢菌的發酵控制。

1 發酵裝備的關鍵點和相關改進

發酵罐在使用之前,需要認真檢查,以消除設備隱患,還要重點注意以下幾個方面。

1.1 發酵罐機械密封

機械密封目前在發酵罐上得到廣泛應用，利用機械密封動靜環的旋轉摩擦密封取代了以前攪拌軸填料函密封形式。由于動靜環的旋轉摩擦需要潤滑，通常采用無菌水潤滑動靜環接觸旋轉部位，但是黑槌蟲草羽束梗孢菌發酵周期較長，在自然蒸發和發酵罐上攪拌電機散熱風扇的風力共同作用下，潤滑的水容易蒸干，如果值班人員沒有注意，動靜環旋轉摩擦時會發出異響和振動，導致密封失效而發生泄露，很容易造成發酵染菌。為此，我們在發酵罐的動靜環接觸旋轉部位用甘油代替了無菌水，在發酵罐進行實消時將固體甘油抹在動靜環接觸旋轉部位邊上，利用發酵罐實消時的熱量將甘油融化，滲入動靜環，等到發酵罐實消結束后仍然有油膜留在動靜環接觸面上，從而實現良好潤滑。

經過黑槌蟲草數批次的發酵，證明此方法簡單可靠，降低了值班人員的操作失誤，提高了發酵成功率。

1.2 管道

管道的連接一般有焊接、螺紋連接和法蘭連接三種，在我所發酵中試車間，法蘭連接是發酵管道連接的主要方式。法蘭之間一般均采用石棉墊片，但是黑槌蟲草的發酵產物由于可以作為食品或藥品使用，法蘭之間不能采用有毒的石棉墊片。因此凡是能夠與發酵液接觸的管道連接法蘭墊片都更換成了聚四氟乙烯墊片。這種材料無毒、耐高溫、耐腐蝕、有彈性、不吸水，除了價格高外十分適合發酵行業。但聚四氟乙烯墊片高溫時在法蘭緊固螺栓的作用下，會發生塑性變形，使法蘭緊固螺栓松動，導致法蘭連接不緊密而泄露。因此在法蘭經過高溫蒸汽之后，必須要重新緊固連接螺栓。

發酵罐內一般設置有視鏡來觀察發酵液的情況，在罐內也配有相應沖洗透鏡的的蒸汽管道，蒸汽如果冷凝在管道中，就失去了滅菌能力，為消除黑槌蟲草羽束梗孢菌的染菌隱患，應去除這類蒸汽管道。

1.3 空氣凈化系統

目前國內的膜過濾技術比較成熟，用聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的折疊微孔濾膜濾芯，過濾精度可達0.01μm，過濾效率高，高流速高通量，,疏水性強，可反復熱壓消毒，在工業領域大量使用，已經替代了傳統的活性炭、棉花、超細玻璃纖維為過濾介質的過濾器。

如果空氣過濾器的除菌質量不好，將會使過濾后的空氣含有雜菌，如果雜菌數量很少，采用間斷取樣檢測不容易檢測出來，誤以為空氣質量合格，容易造成發酵失敗。針對黑槌蟲草發酵，采用了連續空氣檢測方法，在最后一級的過濾器后掛了一個空氣測樣瓶，瓶中是滅菌后不接種的LB細菌培養基，連續通入過濾后的空氣。只要觀察到培養基保持清澈，就說明過濾器運行正常。如果發酵罐發生染菌，我們也可以據此判斷染菌原因，采用正確的處理方式。在黑槌蟲草羽束梗孢菌發酵中車間各級發酵罐的過濾器連續使用2個月，鏡檢空氣測樣瓶無菌。

在系統的總空氣過濾器前，應設置前置空氣過濾器，對出自空壓機的空氣進行脫油、脫水和部分除菌，以減輕總空氣過濾器的壓力。對于每一個發酵罐，應配備獨立的可滅菌的空氣過濾器。

1.4 閥門

閥門在發酵設備中使用最多，采用的閥門也有各種型號，有條件的發酵車間使用專用的二通閥或隔膜閥[3]。考慮到閥門使用成本和易于維護，在我所中試車間用的最多是截止閥，發酵閥門對密封的要求高，使用中開閉比較頻繁，對內部密封副的磨損較大，普通的密封結構不適用發酵，因此針對發酵特點對內部密封副進行了改進，將原截止閥的硬密封密封副改成了軟密封，密封關閉件用聚四氟乙烯墊片。由于聚四氟乙烯材料較軟，墊片可以自行加工，通過更換聚四氟乙烯墊片來保證閥門的密封。避免由于密封副泄露而整體更換閥門，即降低了發酵染菌風險也大幅降低了成本。

發酵閥門也要密切注意閥門外密封泄露，對于截止閥，從閥桿處發生的泄露是外密封泄漏。在發酵生產中，閥門的外密封泄漏比較隱蔽，閥門外密封檢查容易忽略，如果不加以注意，很容易造成發酵染菌。在黑槌蟲草羽束梗孢菌發酵前對關鍵閥門逐個進行密封性檢查，并用新型膨脹聚四氟乙烯密封填料替代了常規的石棉和膨脹石墨填料，該填料耐磨耐腐蝕，密封效果比常規的石棉和膨脹石墨填料要好。

2 發酵過程控制

2.1 滅菌時間的控制

發酵滅菌是利用高溫濕熱蒸汽進行滅菌，利用高溫濕熱蒸汽的熱量使微生物細胞內的蛋白質發生不可逆的凝固變化，在很短的時間內造成微生物的死亡。一般常溫微生物在60 ℃、10 min就可以死亡，而芽胞桿菌的芽孢能耐受較高溫度，100 ℃有時數小時才能殺死，因此一般衡量滅菌的徹底于否，是以能否殺滅芽胞桿菌為標準[4]。滅菌溫度越高，滅菌時間越長，滅菌的效果越好，但是又不能任意提高滅菌溫度和延長滅菌時間，否則培養基的有效成分遭到較大破壞[5](滅菌溫度和時間對養分破壞的比較見表1)，影響黑槌蟲草羽束梗孢菌的生長，得不到我們需要的合格菌絲體。

表1 滅菌溫度和時間對養分破壞的比較

由于黑槌蟲草培養基中有豆類粉末，不易滅菌，經過實驗，我們確定黑槌蟲草發酵的滅菌溫度控制在115 ℃，時間控制在40 min，即可以保證滅菌質量，又不會損失過多的營養成分。

2.2 發酵參數控制

黑槌蟲草羽束梗孢菌發酵中控制的參數有溫度、罐壓、排氣流量、攪拌速度、pH、溶氧、泡沫等，由于羽束梗孢菌的生長對氧氣需求不大，在現有的通氣條件下，溶氧基本保持不變，因此為避免增加染菌風險和保護電極，溶氧電極可以不用放置。羽束梗孢菌的生長對溫度變化要求不高，發酵時溫度的控制方式用開關控制即可。其他部分控制參數見表2。

表2 部分發酵罐的控制參數

發酵液的pH在黑槌蟲草發酵中用于監測羽束梗孢菌的生長是否正常，如果發酵液pH值在發酵中基本保持不變，說明羽束梗孢菌生長正常，如果發酵液pH值出現向上或向下的趨勢，則此次發酵極有可能染菌。對黑槌蟲草的發酵而言，還可以通過發酵排氣的味道來判斷是否染菌和發酵情況，在正常情況下，排氣沒有任何異味，如果出現酸味等異味，則說明已經染菌，而在發酵后期，當出現微微的苦味時，則意味羽束梗孢菌生長到了末期，這時取樣，發現發酵液變成澄清透明的淡棕黃色，味苦無異味，鏡檢菌球直徑2～3 mm，大小均勻，發酵液殘糖檢測不超過0.5%，可終止發酵，菌絲體的得率可達2.5%。

發酵產生的泡沫一直是造成染菌的重要原因[6]，由于培養基中的豆類成份和黑槌蟲草羽束梗孢菌發酵過程中代謝產物均會產生泡沫，如果不能把泡沫壓制在罐中，一旦與外界空氣接觸，極易造成染菌導致發酵失敗，因此減少泡沫產生也是黑槌蟲草羽束梗孢菌發酵的重點防控措施。黑槌蟲草發酵產生泡沫主要在兩個階段，第一階段是在發酵液滅菌時，發酵液沸騰產生泡沫，滅菌時一定要控制泡沫不能沖出罐外造成逃液。由于黑槌蟲草羽束梗孢菌的特殊性，培養基中不能加入工業消泡劑，而市場上的食品消泡劑又對羽束梗孢菌的品質和生長造成影響，黑槌蟲草發酵采用食用豆油作為消泡劑，但是效果不如工業消泡劑，而且為了不影響羽束梗孢菌的生長也不能多加，這就對滅菌操作提出較高要求。這時應該對培養基進行預處理，提前在罐外對培養基煮沸，將培養基中的發泡物質消耗一部分，再進行罐內發酵液滅菌時會顯著降低泡沫量。第二階段發酵液產生泡沫是在羽束梗孢菌發酵過程中，隨著培養基養分的消耗，羽束梗孢菌生長導致自身代謝產物增加，發酵過程中會出現泡沫。對于種子罐的泡沫一般采取調整發酵參數，例如降低攪拌速度，降低進氣流量和適當提高種子罐的罐壓力來解決，如果種子罐泡沫控制困難時，應及時轉入下一級種子罐，這樣逐級放大，一直到最后一級的發酵罐，而在最后一級的發酵罐中，除了采用調整發酵參數來控制泡沫外，還可以通過無菌管道加入經滅菌的食用豆油來控制泡沫。

2.3 接種、移種和取樣控制

黑槌蟲草羽束梗孢菌的菌種接入采用火焰封閉接種口，然后快速導入菌種的方式，接種環節十分關鍵，接種過程中如果接種口火焰未能全部封閉接種口，或者火焰受到干擾，以及菌種沾在了接種口上，均增加了染菌的風險。因此在接種前提前用紫外燈對環境殺菌，接種時關閉門窗，用酒精擦拭接種口，檢查火焰接種環，打開排氣閥排氣，罐內殘余有微弱壓力是關閉排氣閥，注意關閉排氣閥的時間，過早關閉排氣閥會使罐內殘余氣流過多，接種口打開時氣流沖出會吹滅火焰，過晚關閉排氣閥會使罐內壓力跌零增加染菌風險。接種口打開后立即稍開進氣閥門，使發酵罐保持微弱正壓，接種時避免受到環境氣流干擾，快速倒入。

發酵生產是一個逐級放大的過程，當種子罐中黑槌蟲草羽束梗孢菌生長到穩定期，即可進行移種操作。如果罐和罐之間有固定管道連接則相對容易，管道用150～200 kpa蒸汽滅菌30 min并保持正壓。如果發酵罐之間沒有設計管道連接，這時可以用硅膠管作為臨時的移種管道，移種硅膠管的管壁厚度應在1 mm以上，各罐的附屬蒸汽管道粗細不同時，宜使用較粗蒸汽管道的蒸汽作為滅菌蒸汽，硅膠管內部的流通蒸汽壓力保持150 kpa以上，滅菌時間30～40 min。

為了掌握羽束梗孢菌的生長情況，確定移種時間，發酵過程中要適時取樣，但同時也增加了染菌風險，因此操作人員必須嚴格取樣操作。取樣管道滅菌時滅菌蒸汽必須連續流通，不容許出現死點。由于發酵生產中，有些閥門安裝時其標注流向與發酵液流向是相反的，這時需在該閥門的底部加裝一個小的附加閥門使蒸汽流通。要加強對取樣閥的外密封結構的檢查，防止發酵液從外密封結構中泄漏，造成發酵染菌。

發酵滅菌時只有蒸汽流通才有滅菌的效果，對不流通的管道、閥門，必須采用上文方式改造使蒸汽流通。然后無菌空氣保持正壓，避免雜菌侵入。

總之，可能導致新疆黑槌蟲草羽束梗孢菌發酵失敗的原因很多，主要有設備泄露、空氣帶菌、滅菌不透，操作不當等，發酵后期的染菌將使前期的工作前功盡棄，給生產造成很大損失，這就要求我們在發酵生產中，對發酵生產的每一個環節嚴加控制，既要做好常規檢查，也要做好專項防控，杜絕發酵染菌的隱患。