全真一氣湯通過(guò)ACTA2調(diào)節(jié)COPD大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞收縮功能

蔡志勝，王春娥，陳可強(qiáng)

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)作為目前全球第四大疾病死因的呼吸系統(tǒng)疾病，以持續(xù)性的呼吸道癥狀和氣流受限為特征[1]。若治療不當(dāng)或延誤治療，將產(chǎn)生眾多并發(fā)癥，其中慢性肺源性心臟病便是COPD最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一[2]。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)收縮導(dǎo)致的低氧性肺動(dòng)脈高壓(Hypoxic pulmonary hypertension，HPH)被認(rèn)為是慢性肺源性心臟病發(fā)病的前提及核心環(huán)節(jié)[3]，但是肺動(dòng)脈平滑肌收縮的機(jī)制尚未完全明確。平滑肌是一種特殊的肌肉類型，具有控制或調(diào)節(jié)收縮和松弛的能力，覆蓋呼吸系統(tǒng)中從氣管到肺組織的大部分區(qū)域。先前的研究發(fā)現(xiàn)全真一氣湯可以通過(guò)調(diào)節(jié)ACTA1改善COPD大鼠呼吸肌無(wú)力的癥狀[4]，促進(jìn)呼吸肌的收縮。ACTA2是ACTA1的特異性同工型蛋白，由ACTA2基因編碼的平滑肌肌動(dòng)蛋白α被認(rèn)為對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的收縮功能起關(guān)鍵作用[5-6]。在中醫(yī)學(xué)研究中，結(jié)合COPD的臨床癥狀，現(xiàn)代中醫(yī)醫(yī)家認(rèn)為COPD發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在因素主要與肺脾腎三臟功能失調(diào)密切相關(guān)，發(fā)病初期主要表現(xiàn)為肺氣虛，后期累及腎臟。在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)[7-9]，對(duì)COPD腎不納氣證患者進(jìn)行西醫(yī)治療配合內(nèi)服全真一氣湯中藥湯劑能夠顯著改善癥狀，延緩肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生，提高患者生活質(zhì)量，但作用機(jī)制尚不明確。為進(jìn)一步探索全真一氣湯的多靶點(diǎn)機(jī)制，研究使用全真一氣湯干預(yù)COPD大鼠，通過(guò)檢測(cè)大鼠肺組織中ACTA2基因及蛋白水平，探討全真一氣湯對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌收縮功能的調(diào)節(jié)作用。

1 主要材料與試劑

1.1 動(dòng)物

SD大鼠18只，體質(zhì)量180～220 g，清潔級(jí)。采購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(NO：70092411)。于福建中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心鼠類實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行本研究醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)，清潔級(jí)。動(dòng)物使用符合福建省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)管理?xiàng)l例。

1.2 藥物

根據(jù)明末清初醫(yī)家馮楚瞻[10]所著《馮氏錦囊秘錄》中的名方全真一氣湯將生藥制成40%的濃縮湯劑(組方：生曬參15 g，麥門冬15 g，熟地黃15 g，黑順片6 g，炒白術(shù)6 g，川牛膝15 g，五味子6 g)。中藥制法：①稱量藥材226 g，經(jīng)蒸餾水浸30 min后煮沸，煮沸后再煎30 min，注意均勻攪拌，再經(jīng)3層紗布過(guò)濾，取濾液；②得濾渣，加入蒸餾水再次將其煮沸后續(xù)煎20 min，再經(jīng)3層紗布過(guò)濾，取濾液；③將所得的2次濾液充分混勻后，將其濃縮成含原材料1.0 g/mL的水煎液226 mL。藥液常溫冷卻后，放至4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。原藥材采?gòu)于福建省藥材公司，濃縮中藥湯劑由福建省第二人民醫(yī)院制劑中心制作。

1.3 試劑與儀器

兔抗大鼠ACTA2抗體(美國(guó)Santa Craz公司)；Rat_Gapdh_primer(TaKaRa公司，編號(hào)：D379212)；ExScriptTM RT Reagent Kit試劑盒(TaKaRa公司，編號(hào)：DRR037A)；SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒(TaKaRa公司，編號(hào)：DRR820A)；RNAiso Plus(TaKaRa公司，編號(hào)：D9108A)；7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；Westen-blotting(美國(guó)BIO-RAD)。

2 方法

2.1 分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法將18只清潔級(jí)健康雄性大鼠隨機(jī)分為中藥組與模型組，每組各9只。

2.2 動(dòng)物模型建立

采用10%水合三氯乙醛于實(shí)驗(yàn)第1天、第11天、第21天經(jīng)腹腔注射麻醉兩組大鼠，取仰臥位，固定四肢及頭部，行手術(shù)切開(kāi)氣管，經(jīng)氣管注入內(nèi)毒素脂多糖200 μL(1 mg/mL)。旋轉(zhuǎn)固定板，盡可能地使內(nèi)毒素脂多糖充分均勻地分布于大鼠雙肺。自制有機(jī)玻璃熏箱，熏箱的大小規(guī)格為30 cm×40 cm×50 cm。第2天起將所有大鼠置于該熏箱內(nèi)進(jìn)行COPD造模，箱內(nèi)煙熏濃度設(shè)置為5%。除氣管內(nèi)滴注日不對(duì)大鼠進(jìn)行煙熏外，每天均保持煙熏30 min，持續(xù)煙熏60 d。造模期間觀察小鼠的一般情況。

2.3 給藥方法

自第2天起，于每日上午8-9點(diǎn)，在熏煙前對(duì)中藥組大鼠給予藥物灌胃干預(yù)。灌胃前稱量大鼠體質(zhì)量，按照0.4 mL/20 g的藥物劑量每日灌胃1次。模型組大鼠每日予0.9%生理鹽水5 mL灌胃1次。灌胃給藥前利用水浴法升高濃縮湯劑溫度至與大鼠正常體溫38 ℃接近，連續(xù)灌服60 d。

2.4 樣本取材

經(jīng)過(guò)60 d持續(xù)煙熏完畢，采取隨機(jī)取樣原則，每組隨機(jī)選擇3只大鼠樣本，將樣本大鼠頸椎脫臼處死后，浸入75%濃度的乙醇溶液中，5 min后將轉(zhuǎn)移樣本大鼠到超凈工作臺(tái)，隨后樣本大鼠仰面固定于解剖臺(tái)上，用75%乙醇消毒胸部后，沿胸部正中線剪開(kāi)皮膚，充分暴露樣本大鼠胸腔，取右肺組織后利用消毒完畢的錫箔紙包裹標(biāo)本并放入液氮中速凍，再轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱中保存，以便用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)。

2.5 觀察指標(biāo)與測(cè)定方法

2.5.1 一般狀況 每日觀察兩組大鼠的毛發(fā)光澤、呼吸情況、精神狀態(tài)、飲食及攝水量狀況及重量改變情況等。

2.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 取大鼠右肺組織標(biāo)本100 mg于研缽中加液氮快速研磨，總RNA采用TRIzol(invitrogen)法抽提取，總RNA提取后加入DNA酶對(duì)基因組進(jìn)行消化，用ExScriptTM RT Reagent Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒以7500 Software v 2.0.5進(jìn)行熒光擴(kuò)增。使用SYBR Green I嵌合熒光法，Genebank序列(寶生物工程(大連)有限公司)檢測(cè)基因的上下游引物序列，見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，GAPDH作為內(nèi)參照。以模型組mRNA的表達(dá)量為“1”，再依據(jù)校正值計(jì)算中藥組mRNA的含量，并比較各組間表達(dá)量。所有步驟均嚴(yán)格按照試劑盒操作流程進(jìn)行。

表1 檢測(cè)基因的引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度

2.5.3 Western blot檢測(cè)ACTA2蛋白水平 按1∶10的比例將稱量后大鼠右肺組織塊生理鹽水沖洗后加入相應(yīng)的裂解液中，充分混勻后低溫離心，離心后取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入緩沖液，100 ℃變性，取20 μg電泳，電泳完畢后轉(zhuǎn)印至PVDF膜。室溫下將膜封閉于5%的脫脂奶粉中1 h，加入一抗(ACTA2；CST公司)，在4 ℃下孵育過(guò)夜。隔日加入二抗(碧云天)，在室溫下孵育1 h后使用TBST將膜充分洗滌，ECL檢測(cè)標(biāo)本膜上的信號(hào)。

2.5.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各組數(shù)值用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般狀況比較

兩組大鼠均無(wú)死亡。兩組大鼠熏煙初期均喜扎堆聚集，后漸出現(xiàn)咳嗽、噴嚏、喘息等癥狀。模型組大鼠精神倦怠、靜臥懶動(dòng)、呼吸困難，胸廓活動(dòng)明顯，出現(xiàn)點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)，并有較多質(zhì)地清稀的分泌物自鼻腔流出，毛發(fā)枯黃，部分大鼠有毛發(fā)脫落現(xiàn)象，飲食及攝水量減少，大便稀軟，體質(zhì)量減輕。而中藥組大鼠一般狀況較模型組有所改善。

3.2 PCR結(jié)果

中藥組ACTA2mRNA的表達(dá)相比于模型組有所下調(diào)，表達(dá)豐度是模型組的0.718倍。P值為0.017，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖1、表2。

注：中藥組與模型組比較，P<0.05。

表2 各組COPD大鼠ACTA2mRNA表達(dá)豐度

3.3 Western blot檢測(cè)

中藥組較模型組ACTA2mRNA蛋白表達(dá)降低。

4 討論

近年來(lái)，我國(guó)40歲以上人群中COPD的發(fā)病率呈進(jìn)行性增長(zhǎng)，但其公眾知曉率卻未明顯升高[11]。這也致使患者在首次求診時(shí)大多癥狀已較為嚴(yán)重，給診治增加了困難。目前COPD的西醫(yī)治療方案主要是通過(guò)應(yīng)用支氣管擴(kuò)張劑(包括β2腎上腺素受體激動(dòng)劑、抗膽堿能藥物及茶堿類藥)和糖皮質(zhì)激素從而達(dá)到控制疾病發(fā)作的效果，但在臨床工作中發(fā)現(xiàn)存在相當(dāng)一部分的患者運(yùn)用目前的治療手段對(duì)癥處理后病情并無(wú)明顯的控制。該部分患者繼發(fā)HPH的概率便會(huì)增加，其生活質(zhì)量將會(huì)降低。而由于COPD患者的長(zhǎng)期缺氧繼發(fā)引起的HPH在發(fā)生初期并無(wú)明顯的特異性臨床表現(xiàn)，故許多COPD患者繼發(fā)HPH時(shí)常不能獲得明確診斷，延誤病情，錯(cuò)過(guò)了早期的治療時(shí)間。

圖2 各組COPD大鼠ACTA2mRNA表達(dá)豐度

隨著現(xiàn)代對(duì)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究的深入，中醫(yī)藥在內(nèi)科學(xué)各方面疾病中表現(xiàn)出不俗的療效。國(guó)內(nèi)許多臨床試驗(yàn)[12]已證實(shí)在COPD階段進(jìn)行中醫(yī)藥配合干預(yù)可以有效防治HPH的發(fā)生，達(dá)到“治未病”的效果?，F(xiàn)代中醫(yī)醫(yī)家普遍認(rèn)為COPD是一種病程較長(zhǎng)，病性以虛為主的慢性虛損性肺系疾病。肺主一身之氣，腎主納肺吸入之清氣，兩臟協(xié)調(diào)有序則氣機(jī)升降出納均勻有度，衛(wèi)氣、宗氣強(qiáng)勁，周轉(zhuǎn)流利，諸邪不干。然，COPD患者多見(jiàn)為中老年人，年事漸高，素體漸衰，正氣漸損。肺為嬌臟，本就易感邪致病，臟腑正氣一旦虧損則易令肺衛(wèi)不固，致使邪氣侵襲肺臟，進(jìn)而使五臟六腑發(fā)生一系列生理及病理的變化，令病情遷延難愈。肺金與腎水為母子之臟，母病常多及子。久咳傷肺，肺病及腎，則腎氣虧虛，腎虛不能攝納，故常表現(xiàn)為肺氣不足，腎納氣不利的癥狀。若肺臟吸入的清氣不能被腎臟所攝納，清氣便游走于氣道與血脈之間，無(wú)法與機(jī)體組織進(jìn)行充分的氣體交換，誘發(fā)低氧性肺動(dòng)脈高壓。明代醫(yī)家李士材在《醫(yī)宗必讀》提出：“正氣不足，而后邪氣踞之”?！端貑?wèn)·評(píng)熱病論篇》亦有云曰：“邪之所湊，其氣必虛”。因此，在COPD的中醫(yī)治療過(guò)程中，應(yīng)重視補(bǔ)腎益肺，始終注意扶正培本。肺氣與腎氣得到補(bǔ)充便能更充分發(fā)揮臟腑功能，吸納更多的自然清氣來(lái)緩解缺氧癥狀，從根本上調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈的壓力。這也與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為提高機(jī)體免疫力可改善COPD患者一般情況的觀念相符合。全真一氣湯全方扶正祛邪，潤(rùn)燥合宜，是治療肺腎氣虛，腎不納氣的名方。方中熟地黃味甘性微溫，入肝腎二經(jīng)，為君藥，配伍臣藥味甘性微寒之麥門冬，上可養(yǎng)陰潤(rùn)肺，下可滋陰濟(jì)腎；佐以性溫之生曬參大補(bǔ)元?dú)?，性大熱之黑順片補(bǔ)火助陽(yáng)；君臣二藥藥力所化陰液得參、附溫?zé)嶂砸詺饣蟿t布津散液于肺，益肺生津，下則輸精于腎，補(bǔ)腎填精；白術(shù)為甘溫之藥，歸脾胃經(jīng)，炒制更添健脾益氣之效，與君臣二藥共劑相配，補(bǔ)益脾土而不至溫燥太過(guò)，滋補(bǔ)陰液而不過(guò)分黏滯；而牛膝作為引經(jīng)藥，引火下行，再加五味子納氣藏源，則可使土金水三臟均調(diào)，一氣而化源。

ACTA2基因位于人類染色體10q23.31，其編碼的ACTA2是人類目前已確定的6種肌動(dòng)蛋白亞型之一。血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)的收縮過(guò)程依賴于由ACTA2組成的微絲與由β-肌球蛋白組成的粗絲之間的循環(huán)相互作用[13]。目前研究發(fā)現(xiàn)，ACTA2與煙霧病[14]、動(dòng)脈瘤[15]、器官纖維化[16]等疾病的發(fā)生有著密不可分的關(guān)聯(lián)。肌動(dòng)蛋白是構(gòu)成細(xì)胞骨架的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。這種基因的突變或缺失會(huì)致使ACTA2構(gòu)成細(xì)胞骨架的功能發(fā)生缺陷[17]，誘發(fā)與血管疾病有關(guān)的多系統(tǒng)平滑肌功能障礙。動(dòng)脈血管的縮窄[18]便是該類患者其中的病理特征之一。當(dāng)表達(dá)ACTA2的平滑肌細(xì)胞大量沉積肺動(dòng)脈壁中，肺血管便會(huì)發(fā)生重構(gòu)，導(dǎo)致肺動(dòng)脈血管的高壓力的產(chǎn)生，甚至發(fā)生右心衰[19]。我們可以認(rèn)為，肺血管管腔的縮小是肺血管重構(gòu)的直接結(jié)果，肺動(dòng)脈高壓是肺血管管腔縮小的癥狀表現(xiàn)。而除了血管重構(gòu)之外，肺血管的收縮也會(huì)導(dǎo)致肺血管管腔的縮小。COPD患者由于持續(xù)的氣流受限，導(dǎo)致肺通氣功能發(fā)生障礙從而發(fā)生缺氧，表現(xiàn)出不同程度的低氧血癥。機(jī)體可通過(guò)收縮肺肌性小動(dòng)脈重新分配血液，將其由低通氣肺泡調(diào)節(jié)至通氣好的肺泡中，從而減輕低氧狀態(tài)下肺部通氣/灌注不匹配的情況。由于COPD患者缺氧狀態(tài)持續(xù)進(jìn)行且不可逆，會(huì)引起肺血管的逐步收縮，導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓力逐步增加。通過(guò)對(duì)COPD患者繼發(fā)HPH的相關(guān)危險(xiǎn)因素分析也發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈壓力與血氧飽和度之間存在較高相關(guān)性[20]。由于氧傳感器感知到血氧分壓(Partial pressure of oxygen，PO2)的降低，導(dǎo)致能引起肺動(dòng)脈收縮的細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)被激活[21]。因此，低氧被視為是引起PASMCs收縮，致使HPH形成的原因之一[22]。

以往關(guān)于PASMCs收縮機(jī)制的研究多集中在離子通道、血管活性因子及氣體信號(hào)分子等方面。如 Ca2+濃度增加是平滑肌收縮的直接因素[23]。缺氧可以引起肌漿網(wǎng)鈣離子釋放肌醇和細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，增加胞內(nèi)游離鈣水平，觸發(fā)PASMCs收縮。ET-B和PGI2等[24-25]血管活性因子表達(dá)異常是導(dǎo)致低氧性肺血管收縮的因素。NO[26]、CO[27]、H2S[28]及H2[29]等氣體具有舒張血管的作用。近些年的研究卻發(fā)現(xiàn)，某些非編碼的RNA(如circRNA、microRNA)在HPH的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮過(guò)作用。這也讓眾多學(xué)者把研究方向集中在探究非編碼RNA的信號(hào)通路及靶點(diǎn)等領(lǐng)域。Tang[30]等研究報(bào)道，ACTA2的表達(dá)受轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor β1，TGF-β1)及神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Intracellular domain of NRG-1，NRG-1-ICD)的影響。TGF-β1是一種可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、調(diào)控細(xì)胞增殖分化等活動(dòng)的多功能性調(diào)節(jié)因子[31]。除了可以通過(guò)促進(jìn)人PASMCs的增殖和遷移誘使血管重構(gòu)的發(fā)生外[32]，TGF-β1還可以增加ACTA2的基因表達(dá)[33-34]。在缺氧誘導(dǎo)的人PASMCs中觀察到作為血管生成積極調(diào)節(jié)因子的TGF-β1顯著上調(diào)[35]。表達(dá)上調(diào)的TGF-β1正反饋于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(Neuregulin-1，NRG-1)，增強(qiáng)了NRG-1的表達(dá)[36]，刺激并增強(qiáng)NRG-1-ICD進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控基因表達(dá)的功能[37]。NRG-1-ICD在進(jìn)入細(xì)胞核后能與ACTA2基因的第一個(gè)內(nèi)含子結(jié)合并誘導(dǎo)circACTA2生成，而作為“分子海綿”的circACTA2可以通過(guò)對(duì)MiR-548f-5p的吸附從而解除其對(duì)ACTA2表達(dá)的抑制[38]，進(jìn)而上調(diào)ACTA2的表達(dá)，促進(jìn)VSMCs中張力纖維的形成和細(xì)胞的收縮[36-37]。

目前現(xiàn)代藥理學(xué)中關(guān)于全真一氣湯組方藥物對(duì)ACTA2基因及其蛋白水平表達(dá)的影響的研究寥寥無(wú)幾。目前僅有研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ具有抑制TGF-β1信號(hào)通路的表達(dá)強(qiáng)度及降低ACTA2的合成的作用[39]。已知TGF-β1能調(diào)控ACTA2的表達(dá)，故我們推測(cè)組方藥物的部分成分可能通過(guò)對(duì)TGF-β1的影響，從而間接調(diào)控ACTA2的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)VSMCs收縮功能的調(diào)節(jié)。研究建立COPD大鼠模型并利用全真一氣湯對(duì)COPD大鼠進(jìn)行灌胃干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，中藥組大鼠的肺組織內(nèi)ACTA2mRNA的表達(dá)豐度是模型組的0.718倍，ACTA2蛋白表達(dá)下調(diào)，表明全真一氣湯可能通過(guò)下調(diào)ACTA2的表達(dá)及活化，調(diào)節(jié)COPD大鼠PASMCs的收縮功能，從而延緩HPH的發(fā)展進(jìn)程。然而，全真一氣湯生藥湯劑化學(xué)成分復(fù)雜，本研究尚未明確能使ACTA2蛋白表達(dá)下調(diào)的具體成分，后續(xù)研究中可在此方面進(jìn)行深入發(fā)掘。