白子菜對2型糖尿病合并急性腎損傷小鼠的保護效應

韋美夢，柳俊輝，李耀華，盧澄生，閆理姣，唐冬偉，梁斐琳，雷夢穎，韋乃球

(廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一組因胰島素絕對或相對分泌不足和(或)胰島素利用障礙引起的糖脂代謝紊亂性疾病，病程久可導致眼、腎、神經、心臟、血管等組織器官的功能減退及衰竭等[1]。2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)為最常見的DM類型，占DM病人的90% 以上[2]。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是DM最常見的微血管并發(fā)癥，也是臨床常見病、多發(fā)病[3]。隨著DM和DN發(fā)病率的增加，T2DM合并急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)的患者也有所增加，尤其是老年患者更易發(fā)生[4-5]。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是一種重要的致炎因子，其誘導的膿毒癥是AKI的常見誘因[6]。

白子菜Gynuradivaricata(L.)DC.為菊科多年生草本植物，又名白背三七、白仔菜、救命草等[7]；其根味甘、性涼，有清熱涼血、散瘀消腫之功效；而莖葉味咸、性涼，有清熱、舒筋、接骨、止血、祛痰的作用[8]。近年來，老百姓以白子菜食、藥兩用，廣泛用于治療胃病、高血壓病、高血脂癥及糖尿病等。已有文獻報道白子菜具有改善胰島素抵抗、降血糖、降血脂、抗氧化、降血壓以及保護高血壓引起的主要器官損傷等作用[9-22]。但是，白子菜對(T2DM+AKI)模型小鼠的保護效應尚未有相關研究報道。本實驗通過建立(T2DM+AKI)小鼠模型，探討白子菜對(T2DM+AKI)的保護效應，并從炎癥反應角度探討其初步療效機制，為開發(fā)白子菜藥用價值方面提供依據。

1 實驗材料

1.1 藥物

實驗藥物采于廣西貴港，經廣西中醫(yī)藥大學藥學院藥用植物教研室的郭敏副教授鑒定，為菊科植物白子菜Gynuradivaricata(L.)DC.的全草。

1.2 動物

雄性KM小鼠，體質量(20±2)g，SPF級，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號為：SCXK(桂)2014-0002。

1.3 試劑

高糖高脂飼料(由普通飼料69.3%、豬油10%、蔗糖20%、食鹽0.5%、膽固醇0.2%組成)，課題組自行配制；鏈脲佐菌素(STZ)(批號：SO130)，Sigma；鹽酸二甲雙胍(批號：180906)，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；4%多聚甲醛組織固定液(批號：1810083)，廣州賽國生物科技有限公司；TNF-α(批號：20190123)、IL-6(批號：20190116)、ICAM-1(批號：20181220)，bioswamp。備注：血清BUN、Scr采用的是全自動生化檢測，全自動生化檢測儀檢測試劑采用配套的一體化檢測試劑包，沒有單獨的試劑批號。

1.4 儀器

ACCU-CHEK羅氏血糖測試儀，羅氏診斷產品(上海)有限公司；UV-1800紫外可見分光光度儀(日本島津公司)；DNM-9602全波長酶標儀(北京普朗新技術有限公司)；德國Eppendorf 5430R臺式高速冷凍離心機(上海艾研生物科技有限公司)；AB204型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；吉爾森P型移液器(深圳市科力易翔儀器設備有限公司)；Aeroset-2000全自動生化分析儀(美國Instrument laboratory公司)；MDF-U7386S超低溫保存箱(日本 SANYO 公司)；電泳儀(美國 BIO-RAD 公司)；全自動化學發(fā)光分析儀(上海天能公司)；電子天平(德國Sartorius公司)；BX51T-PHD-J11顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；RM2015切片機(德國萊卡公司)。

2 方法

2.1 白子菜提取物的制備

取白子菜干品1 kg，加10倍量的水，浸泡1 h后回流提取1.5 h，趁熱過濾，藥渣加8倍量水回流提取1.0 h，趁熱過濾，將兩次濾液混合并搖勻，濃縮藥液，各制成相當生藥2 g/mL的浸膏，置4 ℃冰箱備用。

2.2 動物分組、造模及給藥

取 90 只SPF級KM小鼠適應性飼養(yǎng)3 d，隨機取出 10 只作為正常對照組，其余小鼠隨機平均分為T2DM組、(T2DM+AKI)組、(白子菜高、低劑量+T2DM)組、(白子菜高、低劑量+T2DM+AKI)組、(二甲雙胍+T2DM)組和(二甲雙胍+T2DM+AKI)組。小鼠喂食高糖高脂飼料結合一次性腹腔注射 100 mg/kg 的鏈脲佐菌素復制T2DM模型，T2DM小鼠腹腔注射 LPS(10 mg/kg)復制(T2DM+AKI)模型。給藥組小鼠腹腔注射 LPS前 7 d 開始，用白子菜水煎液灌胃，1次/d，持續(xù) 15 d。除正常對照組外，其余各組小鼠全程喂養(yǎng)高脂飼料直至實驗結束。

2.3 一般情況觀察

觀察各組小鼠飲食及大小便、活動狀態(tài)、精神狀況等。

2.4 空腹血糖的測定

在小鼠第15d末次給藥后，禁食不禁水12 h，尾尖取血，利用羅氏血糖測試儀測定血糖值。

2.5 血清BUN、Scr含量檢測

血液樣品在室溫放置 2 h 后，于4 ℃ 條件3 000 r·min-1離心 10 min，收集血清按試劑盒說明書測定BUN、Scr的含量。

2.6 ELISA 法檢測炎癥反應相關因子

取腎組織，放入勻漿管，稱量后加入9倍量預冷的生理鹽水進行勻漿，勻漿后于4 ℃ 條件3 000 r·min-1離心10 min，并提取上清液按ELISA試劑盒說明書操作檢測TNF-α、IL-6和IL-10含量。

2.7 腎組織病理形態(tài)學的觀察

取腎組織，用預冷生理鹽水進行清洗并稱量，浸于10%甲醛溶液24 h，脫水石蠟包埋，60 ℃條件下固定1 h，并以二甲苯溶液處理10 min，切片依次以梯度乙醇溶液處理，再以 PBS 洗滌3次，每次5 min。進一步以蘇木素染液染色10 min，并用1%鹽酸酒精分化；以促藍液反藍5 s后加伊紅染液染色3 min，再依次用 80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫水，晾干后以中性樹膠封片，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學改變。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 各組小鼠一般行為學觀察

正常對照組小鼠反應靈敏，活動正常，體毛光澤，飲食飲水正常，大便顆粒狀，尿淡黃色，墊料干燥，體質量增加。T2DM 組小鼠反應遲鈍，倦怠蜷臥或煩躁易怒，體毛枯燥，飲食飲水增多，常有腹瀉，尿多，墊料潮濕，體質量減少，(T2DM+AKI)組小鼠上述異常表現更明顯。與T2DM組、(T2DM+AKI)組比較，白子菜各劑量組小鼠各項表現趨于正常。

3.2 白子菜對(T2DM+AKI)小鼠空腹血糖的影響

結果如表 1所示，與正常對照組比較，T2DM組、(T2DM+AKI)組小鼠空腹血糖含量顯著升高，且(T2DM+AKI)組較T2DM組升高明顯。與T2DM組、(T2DM+AKI)組比較，白子菜各劑量組小鼠空腹血糖含量均顯著降低。

表1 對小鼠空腹血糖水平的影響

3.3 白子菜對(T2DM+AKI)小鼠腎功能的影響

結果如表 2 所示，與正常對照組比較，T2DM組、(T2DM+AKI)組小鼠血清BUN、Scr 含量均顯著增加，且(T2DM+AKI)組較T2DM組增加明顯。與T2DM組、(T2DM+AKI)組比較，白子菜各劑量組小鼠血清BUN、Scr含量均顯著減少。

表2 對小鼠BUN、Scr含量的影響

3.4 白子菜對(T2DM+AKI)小鼠腎組織 TNF-α，IL-6和IL-10含量的影響

結果如表 3 所示，與正常對照組比較，T2DM組、(T2DM+AKI)組小鼠腎組織TNF-α、IL-6含量明顯增加，而IL-10含量明顯減少，且(T2DM+AKI)組較T2DM組增加或減少明顯。與T2DM組、(T2DM+AKI)組比較，白子菜各劑量組小鼠腎組織TNF-α、IL-6含量明顯減少，而IL-10含量明顯增加。

表3 對小鼠腎組織TNF-α，IL-6和IL-10含量的影響

3.5 白子菜對(T2DM+AKI)小鼠腎組織病理學的影響

結果如圖 1 所示，正常對照組小鼠腎組織結構正常，腎小管結構清晰，腎小球數目較多且大小均勻，形態(tài)正常，未見炎性細胞。T2DM組、(T2DM+AKI)組小鼠腎小管明顯擴張，腎小球萎縮變形，排列不均勻，數目與正常對照組比較明顯減少，可見嚴重的腎臟損傷，且(T2DM+AKI)組較T2DM組嚴重。同T2DM組、(T2DM+AKI)組比較，白子菜各劑量組小鼠腎小球結構較清晰，數目也增多，大小形態(tài)基本恢復正常，腎小球萎縮現象得到一定程度的緩解。

圖1 各組腎臟病理組織(HE，×200)

4 討論

研究表明，BUN 和 Scr含量增加是AKI的重要標志[23]，而DM或 T2DM和高尿酸血癥之間相互影響，即通過降低血尿酸可改善血糖水平[24-25]。但是，目前對(T2DM+AKI)動物模型的研究甚少，本研究通過鏈脲佐菌素合并腹腔注射LPS的方法復制(T2DM+AKI)小鼠模型。結果表明，與正常對照組比較，T2DM組、(T2DM+AKI)組小鼠腎小球萎縮變形，數目明顯減少，可見嚴重的腎損傷，且(T2DM+AKI)組較T2DM組嚴重；空腹血糖、血清BUN和Scr含量均明顯增加，且(T2DM+AKI)組較T2DM組增加更明顯，說明(T2DM+AKI)小鼠模型復制成功，且高尿酸與高血糖對(T2DM+AKI)有一定的協同作用。與T2DM組、(T2DM+AKI)組比較，白子菜組小鼠腎小球結構清晰，數目明顯增多，大小形態(tài)恢復正常，腎小球萎縮現象得到一定程度的緩解；空腹血糖、血清BUN和Scr含量明顯降低，說明白子菜能夠改善(T2DM+AKI)的異常。

還有研究證實，炎癥反應是導致 AKI 的重要因素，如 AKI 患者血清TNF-α、IL-1β 及 IL-6 均顯著升高[26]。其中，TNF-α介導免疫調節(jié)、炎癥、生長調節(jié)等多方面的效應，可作為診斷早期DN的指標[27]；IL-6 利用自分泌或旁分泌的方式和位于腎小球系膜細胞上的受體相結合，促使細胞外基質的生成及腎小球系膜的增生，引起腎小球硬化癥，進而導致DN的發(fā)生、發(fā)展[28]。還有研究發(fā)現，小鼠腎缺血再灌注模型促炎因子單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等增多，而抗炎因子血紅素氧化酶-1(HO-1)、白細胞介素-10(IL-10)等減少，導致促炎與抗炎反應間的不平衡，從而引發(fā)腎損傷[29]。本實驗研究表明，(T2DM+AKI)小鼠腎組織促炎因子TNF-α、IL-6含量明顯增加，而抗炎因子IL-10含量明顯減少；給予白子菜干預后，小鼠腎組織促炎因子 TNF-α、IL-6含量明顯減少，而抗炎因子IL-10含量明顯增加。

綜上所述，白子菜對(T2DM+AKI)具有保護作用，表現為同時降低空腹血糖、血清BUN和Scr含量，而其機制可能與抑制炎癥反應有關。雖然本研究具體機制尚未清晰，但仍具有一定研究開發(fā)前景，對未來進一步研究提供思路。