不同產地苦參中生物堿類含量測定及指紋圖譜研究

王昊天，葉世蕓*，殷少文，鄭立肯，鑒志剛

(1.貴州中醫藥大學 藥學院，貴州 貴陽 550002；2.貴陽市第三人民醫院 科教科，貴州 貴陽 550006)

苦參是豆科植物苦參(SophoraflavescensAit.)的干燥根[1]。自古以來，苦參在我國就多有應用，如《本草綱目》《滇南本草》《神農本草經》等對其功效均有記載。苦參性寒，味苦，歸心、肝、胃、大腸、膀胱經，具有清熱燥濕、殺蟲利尿之功效，可用于治療陰腫陰癢、濕疹、熱痢便血、皮膚瘙癢及外治滴蟲性陰道炎等病癥，尤宜治療婦科疾病[1-4]。苦參作為常用中藥，在我國分布廣泛，如河南、湖北、河北、內蒙古等地均是其產區[2，5]。苦參含有黃酮、生物堿、木脂素、萜類、微量元素等多種成分[2，4-8]，具有抗炎、調節免疫、鎮痛、抗心律失常、抗癌、抑菌等藥理活性[5-6]。其中，生物堿類及黃酮類成分在苦參中占比較大且為主要的活性成分[2，4]，是現今研究報道的重點。苦參中生物堿類成分更是以苦參堿及氧化苦參堿為主，因此自1963年版《中華人民共和國藥典》就將苦參堿及氧化苦參堿作為苦參的指標性成分，2005年版《中華人民共和國藥典》加入HPLC測定含量也是將這兩種生物堿作為指標成分，至2020年版《中華人民共和國藥典》未改變。隨著中藥產業的發展及研究的深入，僅以苦參堿及氧化苦參堿作為苦參含量測定的指標已無法滿足對苦參的質量控制(如與山豆根的區分)。因此，關于苦參中黃酮類成分、其他生物堿成分及將其作為指標成分的研究報道日漸增多[4，9-11]。關于苦參中生物堿的含量測定及指紋圖譜的研究已有報道，而將兩者結合同時考察的研究較為鮮見。因此，本實驗以4種生物堿作為指標性成分，建立HPLC的含量測定方法，測定不同產地苦參中生物堿類化合物的含量，并建立指紋圖譜，旨在比較不同產地苦參質量，為完善苦參質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(型號：1260 HPLC，廠商：Agilent)；HC-S4高速多功能粉碎機(永康市天琪盛世貿有限公司)；YQ-1000A超聲清洗儀(上海易凈超聲波儀器有限公司)；AE240天平(上海梅特勒有限公司)；藥典篩(紹興市上虞張興沙篩廠)；Welch Ultimate XB-NH2色譜柱(規格：4.6 mm×250 mm，5 μm，廠商：上海Welch公司)。

1.2 試劑與材料

31批苦參產于內蒙古、云南、貴州、陜西等地，均為市售藥材，經貴州中醫藥大學魏升華教授鑒定為豆科植物苦參(SophoraflavescensAit.)的干燥根，產地信息見表1；槐定堿對照品(170425)、苦參堿對照品(170512)、槐果堿對照品(161113)、氧化苦參堿對照品(170428)均購于北京世紀奧科生物技術有限公司；氨水(分析純)、無水乙醇(分析純)、無水乙醇(色譜純)、乙腈(色譜純)均購于天津市科密歐化學試劑有限公司；三氯甲烷(分析純，廠商：上海試劑四赫維化工有限公司)；磷酸(分析純，廠商：成都市科龍化工試劑廠)；水(娃哈哈純凈水，廠商：娃哈哈飲料有限公司)。

表1 31批苦參樣品

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱Welch Ultimate XB-NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相乙腈-無水乙醇-3%磷酸(85∶7.5∶7.5)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長220 nm，進樣量為10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 取對照品槐定堿、苦參堿、槐果堿、氧化苦參堿適量，精密稱定，加入乙腈-無水乙醇(85∶15)溶解定容，分別制成含槐定堿3.74 mg/mL、苦參堿3.77 mg/mL、槐果堿3.61 mg/mL、氧化苦參堿3.98 mg/mL的對照品母溶液。自各對照品溶液中取2 mL，置于10 mL容量瓶中，加入乙腈-無水乙醇(85∶15)定容，制成混合對照品溶液(含槐定堿0.748 mg/mL、苦參堿0.754 mg/mL、槐果堿0.722 mg/mL、氧化苦參堿0.796 mg/mL)，搖勻，備用。根據實驗所需，可稀釋成不同濃度的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取苦參粉末約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入氨水1.5 mL和三氯甲烷25 mL，稱定，超聲30 min，冷卻至室溫，補重，濾過，取續濾液5 mL，水浴蒸干，殘渣加乙腈-無水乙醇(85∶15)溶解，轉移至10 mL容量瓶，定容，用0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系考察 配制不同濃度的混合對照品溶液，測定，以濃度對峰面積進行線性回歸處理，得到4種生物堿線性方程，見表2、表3、表4、表5。

表2 槐定堿線性方程

表3 苦參堿線性方程

表4 槐果堿線性方程

表5 氧化苦參堿線性方程

2.3.2 精密度試驗 取內蒙古3苦參樣品，稱取苦參粉末約0.5 g，制成供試品溶液，連續進樣6次，分別測定。所得4種生物堿峰面積的RSD值為0.88%～2.69%，該儀器和方法精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 取內蒙古3苦參樣品，稱取苦參粉末約0.5 g，制成供試品溶液，分別于0、1、2、3、5、8 h測定。測得4種生物堿峰面積的RSD值為0.47%～1.88%，樣品在8 h內穩定。

2.3.4 重復性試驗 取內蒙古2苦參樣品，稱取苦參粉末6份，每份約0.5 g，制成供試品溶液并測定。測得4種生物堿峰面積的RSD值為1.09%～2.70%，該方法重復性好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取已知含量的苦參藥材(槐定堿、苦參堿、槐果堿、氧化苦參堿含量分別為0.129%、0.984%、0.151%、2.696%)粉末9份，每份約0.25 g，分別加入對照品溶液后(每種對照品溶液的加入量設定3個水平，每水平3份)，制成供試品溶液并分別測定。測得槐定堿、苦參堿、槐果堿、氧化苦參堿的回收率分別為95.08%～104.19%、95.46%～101.15%、95.15%～104.80%、97.28%～104.80%，平均回收率分別為98.23%～103.50%、96.68%～99.26%、97.45%～101.49%、99.58%～102.95%，回收率的RSD值分別為0.92%～2.78%、0.81%～2.93%、2.73%～2.99%、1.69%～2.76%，表明該方法回收率良好。

2.4 多批次苦參飲片中生物堿類成分含量測定

2.4.1 31批苦參樣品4種生物堿含量測定 取31批苦參樣品，制成供試品溶液，進行測定，記錄峰面積并計算各產地苦參中4種生物堿的含量，結果見表6。

表6 不同產地苦參中槐定堿、苦參堿、槐果堿、氧化苦參堿的含量

2.4.2 31批苦參樣品聚類分析 使用SPSS 26.0軟件對31批苦參樣品進行系統聚類分析，以4種生物堿的含量為變量，以瓦爾德法采用平均歐氏距離(d)測定相似度，聚類分析結果見圖1。由圖1可知，當d=15時，31批苦參樣品可聚為兩類，一類為3、23、5、26、16、7、11、22、30，另一類為20、28、10、29、4、6、12、31、2、19、21、24、27、1、15、8、14、18、9、25、17、13；當d=10時，后一類又可聚為兩類，即20、28、10、29、4、6、12、31、2、19、21、24、27聚為一類，1、15、8、14、18、9、25、17、13聚為另一類；當d=5時，13號又獨自聚為一類，即來自貴州2的苦參。

圖1 31批苦參樣品的聚類分析

2.5 苦參HPLC指紋圖譜方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取內蒙古3苦參樣品，制成供試品溶液，連續進樣6次，分別測定，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD值均小于3.00%，該儀器和方法精密度良好。

2.5.2 穩定性試驗 取內蒙古3苦參樣品，制成供試品溶液，分別于0、1、2、3、5、8 h測定，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD值均小于3.00%，樣品在8 h內穩定。

2.5.3 重復性試驗 取同一產地批次苦參樣品6份，每份約0.5 g，制成供試品溶液并測定，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD值均小于3.00%，該方法重復性好。

2.6 31批苦參樣品指紋圖譜建立及相似度評價

將31批苦參樣品制成供試品溶液并測定，記錄色譜圖。根據31批苦參樣品的測定結果，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(國家藥典委員會，2004A版)，建立31批苦參樣品指紋圖譜，以S1為參照圖譜，采用多點校正并進行匹配，生成對照指紋圖譜，共有峰5個，見圖2，與混合對照品溶液色譜圖的相對保留時間進行比較并指認色譜峰。如圖3所示，可知1號峰為槐果堿，2號峰為苦參堿，4號峰為槐定堿，5號峰為氧化苦參堿。通過軟件對指紋圖譜的相似度進行計算，可知31批苦參樣品指紋圖譜的相似度在0.73～0.99之間。

圖2 31批苦參樣品指紋圖譜

注：A.混合對照品溶液；B.空白溶劑；1.槐果堿；2.苦參堿；4.槐定堿；5.氧化苦參堿。

3 討論

3.1 檢測波長選擇及對供試品溶液制備方法考察

在確定色譜條件時，通過對全波段掃描，發現苦參總堿類化合物在220 nm處有最大吸收，所以選用220 nm作為檢測波長。根據文獻和預實驗發現，在供試品溶液制備中，提取溶劑體積、超聲時間對含量影響較大。因此，用單因素考察法分別對三氯甲烷體積(15 mL、20 mL、25 mL、30 mL、35 mL)、氨水體積(0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL)、超聲時間(20 min、25 min、30 min、35 min、40 min)進行了考察，又用響應面優化法分別對三氯甲烷體積(20 mL、25 mL、30 mL)、氨水體積(0.5 mL、1.5 mL、2.5 mL)、超聲時間(20 min、25 min、30 min)的選擇進行了優化，最終確定三氯甲烷體積25 mL、氨水體積1.5 mL、超聲時間30 min為最優方案。

3.2 結果分析

31批苦參樣品指紋圖譜的相似度在0.73～0.99之間，引起相似度低于0.8的苦參樣品產自于貴州，其余苦參樣品間的相似度良好。但根據4種生物堿含量，經系統聚類分析，當d(平均歐氏距離)=10時，可將31批苦參樣品聚分為3類，3、23、5、26、16、7、11、22、30為第一類，20、28、10、29、4、6、12、31、2、19、21、24、27為第二類，1、15、8、14、18、9、25、17、13為第三類。這表明不同產地的苦參樣品間雖有著高度一致的化學成分，但各生物堿的含量各有不同。根據含量測定結果，31批苦參樣品中苦參堿和氧化苦參堿的總量均大于1.2%，符合2020年版《中華人民共和國藥典》的要求。以苦參堿和氧化苦參堿的總量作為依據，總體上第一類的苦參樣品最佳，第二類次之，第三類最差。其中，產于貴州2的苦參，不論是苦參堿和氧化苦參堿的總量，還是4種生物堿的總量，均排在最后，質量最差。這與系統聚類分析中，當d=5時，來自貴州2的苦參獨自聚為一類的結果相符。但來自貴州3苦參中生物堿的含量較高，表明可能貴州省不同批次、不同地區間苦參的質量也存在著差異。產于云南、四川、湖南等地的苦參普遍生物堿含量較高，宜于臨床優先選用。

由含量測定結果可知，4種生物堿在苦參中的含量趨勢由高到低依次為氧化苦參堿、苦參堿、槐定堿、槐果堿，且苦參堿和氧化苦參堿的總量在4種生物堿的總量中占比較高，而這4種生物堿均為苦參的藥理活性成分。氧化苦參堿具有抗腫瘤、抗炎鎮痛、調節免疫等活性[5-6，12-14]。苦參堿具有抗肝損傷、抗心律失常、抗纖維化、鎮靜等諸多活性[5-6，12，15-18]。隨著苦參研究的深入，槐定堿及槐果堿的藥理活性研究也有一定進展。除與氧化苦參堿、苦參堿同樣具有抗菌、抗病毒、抗炎、免疫調節等活性，槐果堿還有抗腹瀉、保肺、抗結腸炎、改善心肌肥厚以及抗柯薩奇病毒的作用[5-6，19-20]。而槐定堿則抗炎作用較強，可應對各種急慢性炎癥，且能抑制細胞免疫及體液免疫[21]。綜上，不同產地苦參中各生物堿含量的差異可能會造成臨床療效的差異，應將含量和藥理活性綜合考慮，選擇指標成分評價苦參的質量。本實驗以4種生物堿作為指標成分，相較以往，補充了槐果堿、槐定堿這兩種苦參中的活性成分，使苦參質量評價更加全面、可靠。經方法學考察，本實驗所用方法方便、可行，可為進一步完善苦參質量控制提供參考。