黃柏質量標準示范性研究

龍倩倩，趙小勤，代 琪，雷 蕾

(1.成都市食品藥品檢驗研究院 國家藥監局中藥材質量監測評價重點實驗室，四川 成都 610045；2.西南民族大學 藥學院，四川 成都 610041)

《中國藥典》經過歷版的不斷修訂，目前已成為世界上質控指標最完善、檢測技術最先進的中草藥標準之一。但通過對比《中國藥典》和《歐洲藥典》《德國藥品法典》發現，部分《歐洲藥典》《德國藥品法典》收錄的中草藥品種前處理相對簡單，使用溶劑更環保，禁用苯、三氯甲烷等毒性較強的試劑，從而更好地保障檢驗人員的身體健康。

黃柏為蕓香科植物黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮，入藥首載于《神農本草經》，列為中品，名曰“檗木”，南北朝時期又名“黃檗”，至近代始有“黃柏”之稱。黃柏具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效，黃柏臨床應用廣泛，中醫藥典籍中收錄含黃柏的方劑眾多，常用于治療濕熱瀉痢、黃疸尿赤、帶下陰癢、骨蒸勞熱等癥[1-3]。

黃柏1963年始收入《中國藥典》[4]，后歷版藥典均有收載。《中國藥典》2020年版中黃柏質量標準項目設置較完善，但存在以下不足：薄層鑒別效果較差且展開劑使用毒性較強的三氯甲烷；含量測定流動相配制較復雜且供試品處理中使用的乙腈較毒。本課題借鑒《歐洲藥典》10.0版和《德國藥品法典》2018年版的思維模式，對黃柏質量標準展開研究，合并黃柏兩個含量測定項為一項，合并薄層鑒別和含量測定的樣品前處理，簡化流動相配制條件，將樣品提取溶劑和薄層展開劑改為低毒試劑，從而優化了原標準，使檢測變得更為簡單快捷、綠色環保。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters-2998高效液相色譜儀，Waters-e2695 Photodiode Array Detector 檢測器，Empower pro自動進樣色譜工作站(美國Waters公司)；Anilent 1260高效液相色譜儀，Anilent 1260 DAD檢測器，LC openLAB自動進樣色譜工作站(美國安捷倫公司)；AUX220電子天平(日本島津公司，1/1萬)；XPE26電子天平(梅特勒-托尼多儀器有限公司，1/100萬)；SK250H超聲儀(250 W，53 kHz，上海科導超聲儀器有限公司)；移液槍(Eppendorf，Germany)等。

1.2 試劑與藥品

鹽酸黃柏堿(94.9%，111895-201805)、鹽酸小檗堿(85.9%，110713-202015)，黃柏對照藥材(121510-201807)，對照品和對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈(色譜純)；其余試劑(分析純)；水(實驗室自制純凈水)。

黃柏樣品20批(編號：CD-1、CD-2、CD-3、CD-4、CD-5、CD-6、CD-7、CD-8、CD-9、CD-10、CD-11、CD-12、CD-13、CD-14、CD-15、CD-16、CD-17、CD-18、CD-19、CD-20)，來源信息見表1。

表1 黃柏樣品來源

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 選定薄層鑒別方法 取“2.2.2”項下供試品備用溶液，作為供試品溶液。另取黃柏對照藥材約1 g，同法制成對照藥材溶液。再取含量測定項下鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿的混合對照品溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(參照《中國藥典》2020年版通則0502)試驗，吸取上述兩種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以無水甲酸-水-乙酸乙酯(10∶10∶80)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。其中，以苦參堿、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿混合對照品溶液和1/4濃度的鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿混合對照品溶液對該條件進行系統適用性試驗，結果表明，方法可行，薄層色譜見圖1。

注：1.系統適用性試驗；2.鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿混合對照；3.1/4鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿混合對照；4.黃柏對照藥材；5.CD-1；6.CD-2；7.CD-3；8.CD-4；9.CD-5；10.CD-6；11.CD-7；12.CD-8；13.CD-9。

2.1.2 各薄層條件方法篩選 (1)供試品溶液制備：①按《歐洲藥典》EP10.0黃連項下薄層鑒別方法處理黃柏樣品，即取0.25 g黃柏粉末，加4 mL的80%甲醇溶液，超聲10 min，過濾，用80%甲醇溶液2次清洗殘留物，每次2 mL，合并溶液并用甲醇稀釋至20 mL，作為供試品溶液1；②按《中國藥典》2020年版黃柏項下薄層鑒別方法處理黃柏樣品，即取本品粉末0.2 g，加1%醋酸甲醇溶液40 mL，于60℃超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液2；③按“2.1”選定方法處理，作為供試品溶液3。

(2)對照品溶液制備：分別取鹽酸黃柏堿對照品、鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加1%鹽酸甲醇溶液制成每1 mL各約含0.1 mg的對照品溶液，即得。

(3)薄層展開條件及顯色條件篩選：①以三氯甲烷-甲醇-水(30∶15∶4)的下層溶液為展開劑，置氨蒸氣預飽和的展開缸內展開[1]；②以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)為展開劑[6-7]；③以正丁醇-冰醋酸-水(7∶2∶5)為展開劑[8]；④以無水甲酸-水-乙酸乙酯(10∶10∶80)為展開劑。上述條件下展開后取出，晾干，再噴以稀碘化鉍鉀試液，置日光下檢視，薄層色譜見圖2。

注：1.供試品溶液1；2.供試品溶液2；3.供試品溶液3；4.鹽酸小檗堿；5.鹽酸黃柏堿。

由薄層色譜圖可見，按《歐洲藥典》EP10.0黃連項下薄層鑒別方法提取的黃柏樣品，在與鹽酸黃柏堿對照品相同位置無斑點，因此該提取方法不可行；按《中國藥典》2020年版黃柏項下薄層鑒別方法提取的黃柏樣品與選定方法效果一致，但選定方法可直接采用含量測定項下提取溶液，操作更簡便。

薄層展開劑①為《中國藥典》2020年版黃柏項下薄層色譜展開條件，其中三氯甲烷毒性較大，不符合歐盟環保要求；薄層展開劑④展開時間且效果優于展開劑②和③，因此選定薄層展開劑④為本標準薄層展開劑。另有文獻采用乙酸乙酯-甲苯-異丙醇-甲醇-濃氨試液(6∶12∶3∶3∶1)[9]或甲苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-濃氨液(6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)[10]為展開劑，但因甲苯毒性較強，故未進行相關考察。

2.2 鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿含量測定

2.2.1 色譜條件 以InerSustain C18柱(250mm×4.0 mm、5μm)為色譜柱；以1%磷酸二氫鉀溶液為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫：0～20 min，95%～83%(A)；20～28 min，83%～50%(A)；28～33 min，50%～95%(A)；33～35 min，95%(A)；柱溫：35 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長為230 nm。理論板數按鹽酸小檗堿峰計算應不低于3 000。

2.2.2 溶液的制備 (1)對照品溶液：取鹽酸黃柏堿對照品、鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加1%鹽酸甲醇溶液制成每1 mL約含0.1 mg的混合溶液，即得。

(2)供試品溶液：取本品細粉約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1%鹽酸甲醇溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用1%鹽酸甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液2 mL(其余濾液備用)，置10 mL量瓶中，加1%鹽酸甲醇溶液至刻度，搖勻，即得。對照品和供試品溶液色譜見圖3。

注：1.鹽酸黃柏堿；2.鹽酸小檗堿。(A)和供試品溶液(B)HPLC 圖。

2.2.3 線性關系考察 精密稱取鹽酸黃柏堿對照品22.321 mg，置50 mL量瓶中，加1%磷酸二氫鉀溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液母液。將母液分別稀釋至8個不同濃度溶液，按“2.2.1”項色譜條件進樣，測定峰面積，計算線性關系。以進樣量(μg)為橫坐標(X)，峰面積(A)為縱坐標(Y)進行線性回歸，得回歸方程：y=1 587 608.840 7-20 381.838 4，R2=0.999 7。結果表明，鹽酸黃柏堿進樣量在0.021 2～4.236 5μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

精密稱取鹽酸小檗堿對照品102.260 mg，置50 mL量瓶中，加1%磷酸二氫鉀溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液母液。將母液分別稀釋至8個不同濃度溶液，按“2.2.1”項色譜條件進樣，測定峰面積，計算線性關系。以進樣量(μg)為橫坐標(X)，峰面積(A)為縱坐標(Y)進行線性回歸，得回歸方程：y=3 687 823.565 6x+50 162.086 6，R2=0.999 6。結果表明，鹽酸小檗堿進樣量在0.175 7μg～17.568 3μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.4 穩定性試驗 取同一批樣品(CD-3)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h測定鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿的峰面積，RSD分別為1.88%、1.47%；另取鹽酸黃柏堿對照品溶液(0.098 53 mg/mL)，鹽酸小檗堿對照品溶液(0.090 26 mg/mL)分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h測定鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿的峰面積，RSD分別為0.88%、1.43%。結果表明供試品溶液和對照品溶液在24 h內穩定。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液和供試品溶液(“2.2.4”項下對照品溶液和供試品溶液)重復進樣6次，進樣10μL，測定峰面積，結果顯示RSD均<1.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 按擬定的含量測定方法，對同一批樣品(CD-3)，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，測定含量，RSD分別為1.26%、1.98%，結果表明本方法有較好的重復性。

2.2.7 準確度試驗 取已知含量(鹽酸黃柏堿為6.143 4 mg/g，鹽酸小檗堿為55.457 9 mg/g)的黃柏供試品(CD-3)9份，每份約0.5 g，精密稱定，分成3組，每組3份，3組分別按照供試品中鹽酸黃柏堿含有量的50%、100%、150%加入鹽酸黃柏堿對照品溶液(濃度為0.423 7 mg/mL)4 mL、8 mL、12 mL；按3組供試品中鹽酸小檗堿含有量的50%、100%、150%加入鹽酸小檗堿對照品溶液(濃度為1.756 8 mg/mL)8 mL、16 mL、24 mL。按擬定的方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件進樣，測定峰面積，分別計算回收率，結果鹽酸黃柏堿的回收范圍為100.54%～103.20%，鹽酸小檗堿的回收范圍為97.68%～100.50%，RSD值均小于2%。結果見表2、表3，試驗結果表明本方法準確度良好。

表2 鹽酸黃柏堿準確度實驗結果 (n=3)

表3 鹽酸小檗堿準確度實驗結果 (n=3)

2.2.8 樣品含量測定 取表1中的黃柏藥材、飲片樣品適量，每個樣品平行3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，計算各批樣品中鹽酸黃柏堿和鹽酸小檗堿的含量，結果見表4。

表4 樣品鹽酸黃柏堿和鹽酸小檗堿含量測定結果 (n=3)

2.3 其他檢驗項目

經研究，《中國藥典》2020版一部黃柏項下性狀及顯微鑒別描述準確，水分、灰分、浸出物的規定合理。20批黃柏樣品水分、灰分、浸出物見表5。

表5 樣品水分、總灰分、浸出物含量測定結果 (n=3)

3 討論

3.1 薄層顯色條件的考察

經考察發現，選用三批樣品(CD-1、CD-2、CD-3)采用本標準選定條件提取供試品溶液，以無水甲酸-水-乙酸乙酯(10∶10∶80)展開后，晾干，立即置紫外光燈(365 nm)下檢視，鹽酸黃柏堿無斑點檢出，但放置12 h后，再置紫外光燈(365 nm)下檢視，鹽酸黃柏堿有明顯斑點檢出，因此，也可選用展開后，晾干，放置12 h后，置紫外光燈(365 nm)下檢視為薄層顯色條件，該方法不需配制顯色劑，更為經濟環保，但考慮到檢品通常具有時效性，本標準未采用該方法，薄層圖見圖4。

注：1.CD-1；2.CD-2；3.CD-3；4.鹽酸黃柏堿；5.鹽酸小檗堿

3.2 提取溶媒的選擇

參考黃柏質量標準含量測定相關文獻[11-14]，共考察了6種溶媒：乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50)(每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g)、乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.2 g)(36∶64)、1%鹽酸甲醇溶液、1%醋酸甲醇溶液、0.2%鹽酸甲醇溶液、0.2%醋酸甲醇溶液，結果顯示，鹽酸黃柏堿溶媒2和溶媒3提取效果較好，鹽酸小檗堿溶媒1和溶媒3提取效果較好，但1和2兩種溶媒提取均配制較繁瑣且乙腈毒性較大，溶媒3毒性較低且配制簡單，且提取效果與溶媒1和溶媒2差別不大，因此，本標準選定溶媒3為提取溶劑。

3.3 流動相選擇

《中國藥典》2020版黃柏項下[1]，以乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50)(每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g)測定鹽酸小檗堿，乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.2 g)(36∶64)測定鹽酸黃柏堿，兩種流動相配制均較繁瑣。查閱相關文獻[8-14]，黃柏含量測定多數均采用乙腈-鹽溶液為流動相，配制也較復雜。也有提到采用乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動相[15]，但經試驗峰形較差。最終參考《歐洲藥典》EP 10.0黃連含量測定項下方法[5]，為保護色譜柱，經試驗在保證峰形和分離度不變的前提下，進一步降低鹽溶液濃度，最終以乙腈-1%磷酸二氫鉀溶液為流動相。

4 結論

本課題調研多篇文獻，嘗試從以人為本的角度，在保證檢測效果的前提下，盡可能為檢驗者提供更簡單、快捷、綠色的檢測標準。目前《中國藥典》項下中藥材和中成藥涉及的儀器和技術越來越先進，質控體系也越來越完善，但因歷史原因，前期起草的部分標準可能會存在一些可提高的地方。本研究參考《中國藥典》項下黃柏標準，借鑒《歐洲藥典》和《德國藥品法典》思維模式，制定黃柏新標準時盡可能綠色簡單，希望能為大家在以后制定標準時提供參考。