基于標(biāo)準(zhǔn)湯劑的檳榔、焦檳榔配方顆粒特征圖譜研究

馬智玲，萬瑩瑩，張志強，沈建梅

(北京康仁堂藥業(yè)有限公司，中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，北京市中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，北京 101301)

檳榔為傳統(tǒng)常用中藥之一，歷代在使用檳榔時均有生、熟之分，認(rèn)為“急治生用，緩治略炒”[1]。檳榔主要含生物堿(包括檳榔堿、檳榔次堿、去甲檳榔次堿等，它們均與鞣酸結(jié)合而存在)、鞣酸、脂肪、氨基酸等，其中以檳榔堿含量最高，藥理學(xué)研究表明檳榔堿有驅(qū)蟲、刺激交感神經(jīng)、興奮M膽堿受體、提神等作用[2-5]，是檳榔驅(qū)蟲、消積的主要有效成分；現(xiàn)代研究認(rèn)為檳榔中的鞣酸類成分具有抗病毒、抗菌[6]、降血壓[7]和抗癌[6]的作用。檳榔經(jīng)過炒焦后其化學(xué)成分的含量發(fā)生變化，是功效發(fā)生改變的原因。惠秋沙等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)，檳榔炮制后，相較于生品，焦檳榔中檳榔堿的含量下降了50.70%；醚溶性生物堿下降了41.78%；鞣質(zhì)含量略有降低，下降率為3.8%；脂肪油的下降率為8.5%，亞油酸和氨基酸含量均低于生品。孫立靖[10]發(fā)現(xiàn)鞣質(zhì)在炮制過程中，呈現(xiàn)先升高而后降低的趨勢，鞣質(zhì)含量測定結(jié)果為炒黃樣品﹥檳榔生品﹥焦檳榔﹥檳榔炭品。彭偉[11]測得檳榔炒焦后水提液中多糖含量明顯增高，單糖組成種類變化雖然不明顯，但是比例卻有明顯變化。

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒而成，由于中藥配方顆粒經(jīng)一系列現(xiàn)代制備工藝加工制成后，在性狀和顯微鑒別上已經(jīng)完全不同于原藥材，如何給中藥配方顆粒貼上個性化標(biāo)簽是目前的一個研究重點，而對于物質(zhì)基礎(chǔ)較為一致的不同炮制品的中藥配方顆粒來說這又是重點中的難點。標(biāo)準(zhǔn)湯劑是遵循中醫(yī)藥理論，按照臨床湯劑煎煮方法規(guī)范化煎煮，固液分離，經(jīng)適當(dāng)濃縮制得或經(jīng)適宜方法干燥制得，是衡量中藥配方顆粒與臨床湯劑基本一致的標(biāo)準(zhǔn)參照物[12]。本研究以檳榔、焦檳榔為例，采用HPLC建立了特征圖譜，并根據(jù)炮制前后化學(xué)成分量值差異及飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑量值傳遞的差異，以標(biāo)準(zhǔn)湯劑的比值差異制定了相應(yīng)的限度，用以區(qū)分檳榔與焦檳榔配方顆粒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：Waters e 2695 HPLC，2489 UV/Vis Detector紫外檢測器，Empower 3色譜工作站；日本島津公司，HPLC-2010 AHT/HPLC-20AT；電子天平：ME104E(梅特勒·托利多)，JY20002(梅特勒·托利多)，BSA-124S(SARTORIUS)；超聲波清洗器KQ-300DB(昆山市超聲儀器有限公司)；色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)(日本安捷倫)，Welch Xtimate C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)(美國月旭)，Waters XTerra MS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)(美國Waters公司)

1.2 試藥

氫溴酸檳榔堿對照品(批號：111684-201602，純度99.8%)、兒茶素對照品(批號：110877-201203，純度99.8%)、檳榔對照藥材(批號：120915-201312)均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈(Fisher 化學(xué)試劑公司)、磷酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)為色譜純，乙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)為分析純，水為屈臣氏純化水；18批不同來源檳榔飲片(YB 01～YB 18)均由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供，18批焦檳榔飲片(YJ 01～YJ 18)均由檳榔飲片嚴(yán)格按照2015版《中國藥典》炮制而成；18批檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑(DB 01～DB 18)、18批檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑(DJ 01～DJ 18)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》藥材煎煮方法相關(guān)要求制備；3批檳榔配方顆粒批號：KB 01、KB 02、KB 03；3批焦檳榔配方顆粒批號：KJ 01、KJ 02、KJ 03。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，柱長為25 cm，柱內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為5 μm；以乙腈為流動相A，0.1%磷酸為流動相B，按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為215 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min，進樣量10 μL。理論塔板數(shù)按檳榔堿峰計算應(yīng)不低于3 000。

表1 梯度洗脫的流動相配比

2.2 對照品制備

精密稱取氫溴酸檳榔堿、兒茶素對照品適量，分別置于容量瓶中，加50%乙醇溶解并定容至刻度線，搖勻，靜置，配制成每1 mL含60 μg氫溴酸檳榔堿、每1 mL含126 μg兒茶素的單一對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

精密稱取檳榔、焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒各0.1 g，置具塞錐形瓶中，加入50%乙醇25 mL，密塞，超聲(功率300 W，頻率40 kHz)處理30 min，取出，放冷，搖勻，以0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4 方法學(xué)考察

通過查閱文獻并與對照品色譜圖進行比對(圖1)，指認(rèn)出2號峰為氫溴酸檳榔堿、4號峰為兒茶素。其中因氫溴酸檳榔堿與兒茶素分離度較好、含量較高、穩(wěn)定，故選擇氫溴酸檳榔堿峰為參照峰1(S1)、兒茶素峰為參照峰2(S2)，計算檳榔、焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑中主要特征峰的相對保留時間的RSD。以檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑(批號：DB 01)、焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑(批號：DJ 01)進行方法學(xué)考察。

圖1 檳榔、焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對照品指認(rèn)指紋圖譜

2.4.1 精密度試驗 精密吸取同一份標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，檳榔、焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑各共有峰相對保留時間的RSD均<3%，符合指紋圖譜要求，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，分別于制備后的 0、2、4、8、12、24 h 注入 HPLC 儀，記錄各峰的峰面積。檳榔、焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰相對保留時間的RSD均<3%，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗 稱取同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品各約0.1 g，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按確定的色譜條件進樣分析。檳榔、焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑各共有峰相對保留時間的RSD均<3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 中間精密度試驗 稱取同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品各約0.1 g，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，更換不同分析人員、實驗日期、儀器，按確定的色譜條件進樣分析。檳榔、焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑各共有峰相對保留時間的RSD均< 3%，檳榔、焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑各儀器間相對保留時間的RSD均< 3%，表明該方法中間精密度良好。

2.4.5 耐用性試驗 稱取同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品各約 0.1 g，按“2.3”項下方法平行制備2份供試品溶液，分別采用不同的流速：0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min，按確定的色譜條件進樣分析，結(jié)果檳榔、焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑各共有峰相對保留時間的RSD均<3%；稱取同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品各約 0.1 g，按“2.3”項下方法平行制備2份供試品溶液，分別采用不同的柱溫 28 ℃、30 ℃、32 ℃按確定的色譜條件進樣分析，結(jié)果檳榔、焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑各共有峰相對保留時間的RSD均< 3%；稱取同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品各約 0.1 g，按“2.3”項下方法平行制備2份供試品溶液，分別采用不同的酸度：0.05%磷酸、0.10%磷酸、0.15%磷酸，按確定的色譜條件進樣分析，結(jié)果檳榔、焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑各共有峰相對保留時間的RSD均< 3%；稱取同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品各約 0.1 g，按“2.3”項下方法平行制備2份供試品溶液，分別采用不同的色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Xtimate C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Waters XTerra MS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，按確定的色譜條件進樣分析，結(jié)果檳榔、焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑各共有峰相對保留時間的RSD均< 5%；表明該方法對不同流速、不同柱溫、不同酸度、不同色譜柱的耐用性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

分別以18批不同批次檳榔、焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑的 HPLC 圖譜色譜峰進行自動匹配，形成共有模式圖，建立對照指紋圖譜，見圖2、圖3。

注：RB 為對照圖譜；DB 01～DB 18 為18批檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品。

注：RJ 為對照圖譜；DJ 01～DJ 18 為18批焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品。

2.6 特征峰相對保留時間規(guī)定值的確定

分別以 18 批檳榔、焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中4個特征峰的相對保留時間的平均值作為規(guī)定值，并結(jié)合方法學(xué)考察中各變動因素對特征峰相對保留時間的影響，確定其規(guī)定值的波動范圍，結(jié)果見表2、表3。最終規(guī)定：供試品特征圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)4個特征峰，以2號峰氫溴酸檳榔堿為參照峰1(S1)，計算峰1與S1的相對保留時間，以4號峰兒茶素為參照峰2(S2)，計算峰3與S2的相對保留時間，各特征峰的相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)。特征峰相對保留時間規(guī)定值為 0.83(峰 1)、1.00(峰 2，S1)、0.80(峰3)、1.00(峰 4，S2)。

2.7 配方顆粒指紋圖譜的測定

取 3 批檳榔配方顆粒樣品(S14～S16)、3批焦檳榔配方顆粒樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下條件進行測定，結(jié)果見圖4、圖5，表2、表3。各共有特征峰相對保留時間和標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照指紋圖譜基本一致，具有很好的重現(xiàn)性，表明建立的指紋圖譜可用于配方顆粒的質(zhì)量評價。

注：RB 為對照圖譜；KB 01～KB 03 為 3 批檳榔配方顆粒樣品。

注：RJ 為對照圖譜；KJ 01～KJ 03 為 3 批焦檳榔配方顆粒樣品。

表2 18批檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑及3批配方顆粒指紋圖譜的相對保留時間

表3 18批焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑及3批配方顆粒指紋圖譜的相對保留時間

2.8 檳榔、焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑及配方顆粒鑒別

用上述方法建立了檳榔及焦檳榔的HPLC圖譜，通過分析研究發(fā)現(xiàn)，以氫溴酸檳榔堿(峰2)為參照峰，特征峰1與其相對峰面積(即β1)，特征峰4與其相對峰面積(即β2)，與檳榔、焦檳榔在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的相對峰面積具有顯著不同，β值見表4。

表4 檳榔及焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒β測定結(jié)果

(峰2：氫溴酸檳榔堿；峰4：兒茶素)

檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑β1范圍為2.46～4.48，而焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑β1范圍為1.24～2.14，檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑β2范圍為3.98～5.07，而焦檳榔標(biāo)準(zhǔn)湯劑β2范圍為1.71～3.37，利用標(biāo)準(zhǔn)湯劑制定出的β1、β2限度值也可區(qū)分出檳榔、焦檳榔配方顆粒。即當(dāng)β1>2.2，β2>3.6時為檳榔配方顆粒，當(dāng)β1不大于2.2、β2不大于3.6時為焦檳榔配方顆粒。

3 結(jié)語

本實驗室自制的 18 批焦檳榔飲片較檳榔中檳榔堿的含量下降率范圍為18.8%～55.0%，均值為39.9%；對檳榔飲片進行炒焦后，其質(zhì)地酥脆，更利于有效成分的煎出，18 批檳榔的檳榔堿轉(zhuǎn)移率范圍為7.20～17.10%，均值為12.4%，18批焦檳榔的轉(zhuǎn)移率范圍為14.20～28.70%，均值為22.2%。故在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中以檳榔堿峰為參照峰，發(fā)現(xiàn)其與峰1、兒茶素峰的峰面積比呈現(xiàn)一定的規(guī)律，對此規(guī)律進行歸納后可制定限度，對二者的配方顆粒進行區(qū)分，該方法直觀、簡便可靠，無需經(jīng)驗。

本研究建立的4個特征峰涵蓋了生物堿和酚類等兩大類活性成分，與檳榔、焦檳榔的藥效作用相關(guān)，具有專屬性；各共有峰的相對保留時間比較穩(wěn)定，說明方法的耐用性良好。本研究建立的指紋圖譜方法能較全面地反映檳榔、焦檳榔配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量，為檳榔、焦檳榔配方顆粒的質(zhì)量控制和評價提供了參考；還能用于配方顆粒及所用藥材、飲片的質(zhì)量評價和鑒定。