PEG脅迫下旱地油菜綠肥苗期抗旱性篩選和評價

張達斌，黃文鳳，惠 蕾，張東亮，李志琴，陳 姣，付 蓉，王朝輝，曹衛東，高亞軍*

（1 西北農林科技大學資源環境學院，陜西楊凌 712100；2 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081；3 農業農村部西北植物營養與農業環境重點實驗室，陜西楊凌 712100；4 中國農業大學資源與環境學院，北京 100083）

黃土高原種植制度傳統上大都為一年一熟或兩年三熟，擁有較為廣闊的(約兩百多萬hm2)夏季裸地休閑面積，占該地區耕地面積的40%左右[1]。由于黃土高原地區夏閑期正值雨熱同季，期間光熱水資源充足，而夏閑期休閑效率較低，一般只有10%～15%，大部分休閑期的降雨并沒有及時存儲于土壤中而無效損失[2]。長年以來，由于不合理的耕作方式以及降水季節性分布不均勻等諸多因素，黃土高原地區水土流失和耕地質量下降等生態環境問題日益突出，嚴重制約了當地農業綠色可持續發展。解決以上問題的一個行之有效的方法就是在夏季休閑期間種植綠肥作物。

綠肥是指能翻耕到土壤里用作肥料的新鮮植物的總稱。綠肥既是優質、清潔的有機肥源，對改良和培肥土壤作用效果顯著，也是可再生的生物資源，可為作物的高產優質奠定基礎[3]。我國綠肥資源豐富、分布廣泛，目前已發現至少98種適應不同耕作制度及自然條件的綠肥種質資源，其中將十字花科油菜用作綠肥作物有著較廣泛的應用前景和市場。相比于其他綠肥品種，油菜具有適應性和抗逆性強，種植地域廣，生長期短且播種期寬松，株體高大，鮮草和干物質產量高，發芽出苗性能優良等特點[4]。與紫云英相比，油菜壓青作綠肥具有營養均衡、干物質量大等優勢。此外，油菜體內含有豐富的硫苷，能有效地殺死有害細菌、蟲卵并抑制雜草的發生[5]。盛花期油菜的碳氮比為20～25∶1，有利于土壤微生物將其礦化分解。油菜為直根系作物，根系腐爛后會形成土壤的孔隙，能提高土壤透氣性，有利于土壤生化反應、改良耕層物理結構[6]。油菜盛花期還田還可以降低土壤容重，增加土壤孔隙度和有機質、全氮、堿解氮、速效磷及速效鉀含量[7?8]。

作為中國典型生態脆弱區和氣候敏感區，黃土高原地區近年來夏季干旱頻發，干旱面積呈擴大趨勢[9]，夏閑期播種的油菜綠肥往往因干旱少雨而導致出苗困難甚至死苗。篩選苗期抗旱能力強的油菜品種，提升其在干旱少雨的夏閑期生存幾率，成為油菜綠肥在我國半干旱和干旱地區推廣和應用的關鍵環節之一。因此，本研究利用PEG-6000模擬干旱脅迫環境，采集了30份參試油菜綠肥苗期的根長、芽長和鮮重等數據，對這些品種苗期的抗旱能力進行了系統評價，以篩選耐干旱脅迫的油菜綠肥品種，為黃土高原夏綠肥推廣應用及未來抗旱綠肥品種的選育提供一定的理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

參試30份油菜綠肥分別來自于陜西榮華雜交油菜種子有限公司、楊凌農業高科技發展股份有限公司、青海省農林科學院春油菜研究所、甘肅省農業科學院作物研究所和陜西省雜交油菜研究中心，其中24份為甘藍型油菜改良品種，6份材料為白菜型油菜。其品種名稱和基因型見表1。

1.2 試驗設計

發芽試驗于2018年6月在培養皿中進行，以正常供水為對照，添加10% PEG-6000模擬干旱脅迫環境。采集的油菜綠肥品種共包含30份參試材料(見表1)，共計60個處理，重復3次，隨機區組排列。

精選成熟飽滿且大小均一的油菜種子各40粒，先用5%的次氯酸鈉溶液消毒 5 min，蒸餾水沖洗干凈后置于培養皿中，以雙層濾紙為芽床，干旱脅迫處理加入PEG-6000溶液10 mL，而對照處理加入等量的蒸餾水，置于25℃恒溫培養箱中黑暗培養8天。培養期間采用稱重補水法每天按時補水，并定時記錄每個綠肥品種種子萌發數和成苗數，種子萌發時間和計數以露白有凸起為標準。培養結束時，在每個培養皿中隨機選取15株具有代表性的幼苗，用直尺測量各參試綠肥幼根和幼芽長度，用百分之一分析天平稱量其鮮重。

1.3 數據處理與分析

參照孫艷茹等[10]、符明聯等[11]、張霞等[12]以及謝小玉等[13]的研究方法，計算成苗率、根芽比(根長∶芽長)、發芽指數、萌發指數、相對活力指數、隸屬函數值、各指標的抗旱系數及抗旱指數、綜合抗旱指數和加權抗旱指數。其中，抗旱系數和抗旱指數計算公式如下所示：

式中，XS、XC分別為干旱脅迫和對照處理參試油菜綠肥品種各指標的測定值；為該指標在干旱脅迫條件下的平均值。

參試30份綠肥品種培養期間發芽指數和萌發指數計算公式如下所示：

式中，Dt、Gt分別為各油菜綠肥種子發芽天數和第t日發芽數；Gr2、Gr4、Gr6和Gr8分別為第2天、第4天、第6天和第8天的綠肥種子發芽率。

參試30份綠肥品種在培養結束時(第8天)的相對活力指數、隸屬函數和綜合抗旱指數計算公式如下所示：

式中，BLs、BLc分別為培養第8天干旱脅迫和對照處理油菜綠肥的芽長；SRs、SRc分別為培養第8天干旱脅迫和對照處理油菜綠肥成苗率；Dcmin、Dcmax分別為各指標抗旱系數的最小值和最大值。

根據灰色系統理論，對各指標按照公式(8)進行Z-score標準化，按照公式(9)和(10)計算關聯系數和關聯度。同時，對參試30份綠肥品種的加權抗旱指數進行聚類分析，劃分抗旱能力等級。分析中涉及的計算公式如下所示：

試驗數據利用Microsoft Excel 2010進行初步計算和作圖，用SPSS Statistics 20.0軟件進行處理和統計分析，處理間多重比較采用LSD法。將30份油菜綠肥的綜合抗旱指數和干旱脅迫下的7個苗期指標進行灰色關聯度分析，研究油菜綠肥苗期萌發特性與抗旱性的相互關系。同時，采用歐式距離和離差平方和(ward linkage)法對品種加權抗旱指數做系統聚類分析，并根據30份油菜綠肥苗期的抗旱能力結果劃分成：抗旱能力強、抗旱能力中等和抗旱能力弱 3個等級。

2 結果與分析

2.1 綜合抗旱性分析

試驗第8天，干旱脅迫條件下參試30份油菜綠肥品種根長介于3.76～18.8 cm，平均11.0 cm，變異系數為23%；芽長介于1.79～4.37 cm，平均2.79 cm，變異系數為15%；根芽比介于1.51～8.85，平均4.04，變異系數為31%；單株鮮重介于15.8～51.2 mg，平均31.5 mg，變異系數為24%。對照條件下，參試30份油菜綠肥品種根長介于1.43～11.5 cm，平均7.63 cm，變異系數為23%；芽長介于2.49～5.22 cm，平均3.71 cm，變異系數為16%；根芽比介于0.32～3.63，平均2.11，變異系數為28%；單株鮮重介于28.5～72.3 mg，平均48.2 mg，變異系數為19%。

由此計算出來的30份油菜綠肥品種綜合抗旱指數介于0.30～0.75，極差為0.45，三等分值為0.151(表2)，最終得出參試油菜綠肥不同抗旱等級的綜合抗旱指數(CDI)區間，≥0.60為抗旱能力強、≥0.45且<0.60為抗旱能力中等、<0.45為抗旱能力弱。利用該指標對參試30份油菜綠肥進行綜合抗旱能力的初步評價，結果顯示：甘雜1號(編號13)、隴油8號(編號15)、秦優28號(編號23)、陜油0913號(編號16)、陜油16號(編號30)、青雜11號(編號17)等17份材料評價結果為強抗旱，占參試綠肥品種的56.7%；另有8份油菜綠肥材料綜合評價結果為中等抗旱；其余5份材料評價結果為弱抗旱。

表2 參試油菜綠肥品種苗期表現及綜合抗旱性評價Table 2 Seedling performance andcomprehensive drought resistance evaluation of the Brassica greenmanure varieties

續表2 Table 2continued

2.2 灰色關聯度分析

根據灰色系統理論，將30份油菜綠肥材料的綜合抗旱指數和干旱脅迫下的7個指標視為一個整體，即灰色系統。將綜合抗旱指數作為母序列，各指標原始數據經公式(8)標準化處理后的值作為子序列，建立灰色系統。由表3可知，在干旱脅迫條件下各油菜綠肥苗期7個測定指標與綜合抗旱指數的密切程度(關聯序)順序為：萌發指數>相對活力指數>根長>芽長>發芽指數>鮮重>根芽比，且關聯度均在70%以上。總體來看，30份油菜綠肥材料的苗期發芽率和根長受干旱脅迫的影響較大。同時，通過測定干旱脅迫條件下油菜綠肥品種的萌發指數、相對活力指數、根長、芽長、發芽指數、鮮重和根芽比，所篩選獲得的70%以上的材料能夠認定為具有較高的抗旱性。

表3 油菜綠肥苗期各指標與綜合抗旱指數的關聯度和關聯序Table 3 Correlation coefficient and order between individual and comprehensive drought-resistance indices (CDI) of Brassica green manure varieties

在獲得各指標和綜合抗旱指數關聯度的基礎上，進一步計算出7個指標的權重，并將各指標的權重與其對應的隸屬函數值相乘再求和，即可得到各油菜綠肥品種的加權抗旱指數(表4)。加權抗旱指數越高，說明該品種抗旱能力越強。這一結果與表2結果相似。

表4 供試油菜綠肥品種苗期加權抗旱指數Table 4 Weighted drought-tolerance index (WDTI) of tested Brassica green manure seedlings variety

2.3 聚類分析

參試30份油菜綠肥的加權抗旱指數經離差平方和法進行系統聚類分析，得到圖1所示聚類圖。當歐式距離為5時，參試材料的抗旱性可聚為HR、MR、LR 3個類群，分別表示抗旱能力強、抗旱能力中等和抗旱能力弱。其中，17個油菜綠肥品種聚為HR類，包括甘雜1號(編號13)、隴油8號(編號15)、秦優28號(編號23)、陜油0913號 (編號16)、陜油16號(編號30)、青雜11號(編號17)、合油雜2號(編號11)、榮華油7號(編號1)、天油11號(編號12)和秦雜油4號(編號8)等材料，占總參試油菜綠肥材料的56.7%。聚入MR類的主要有青雜2號(編號14)、青雜 5號 (編號 2)、青雜7號(編號4)、秦優8號(編號7)、灃油737號(編號19)、陜油28號(編號28)、青油12號(編號3)、天油6-14號(編號6)和天油10號(編號21)共8個品種，占總參試材料的26.7%。聚入LR類的主要有隴油14號(編號5)、揚油9號(編號27)、成油1號(編號18)、延油2號(編號 22)和隴油 12號(編號 20)共5個品種，占總參試材料的16.6%。初步篩選和最終利用加權抗旱指數篩選得到的抗旱能力強和抗旱能力差的油菜綠肥品種基本一致。因此，甘雜1號、隴油8號、秦優28號、陜油0913號、陜油16號和青雜11號等17個油菜綠肥品種具有較穩定的抗旱性。

圖1 干旱脅迫下30份油菜綠肥苗期加權抗旱指數的聚類分析圖Fig. 1 Cluster analysis of the weighted drought-tolerance index (WDTI) of 30 Brassica green manure seedlings varieties under drought stress

2.4 不同抗旱級別油菜綠肥苗期生理指標變化分析

根據上述聚類分析結果，計算并分析抗旱能力強(HR)、抗旱能力中等(MR)和抗旱能力弱(LR)3類油菜綠肥在正常供水（對照）和干旱脅迫條件下其生理指標的變化情況(圖2、圖3)。整體來看，隨著試驗的進行，30份參試油菜綠肥的發芽率逐漸增加(圖2a)。無論是抗旱能力強還是抗旱能力弱的綠肥品種，干旱脅迫環境下參試油菜綠肥苗期的第1、4和8天的發芽率較對照有提升的趨勢，但差異不顯著；不同抗旱能力的油菜綠肥品種間發芽率差異顯著。試驗第1天，HR類17份油菜綠肥材料與MR類和LR類相比具有較高的發芽率，增幅分別為18.6%、185% (P< 0.05)；此外，MR類綠肥材料發芽率較LR類增加140% (P< 0.05)。第4天，HR類油菜綠肥品種平均發芽率為96.5%，與MR類和LR類相比增幅分別為5.5% (P> 0.05)和35.8% (P<0.05)。試驗結束時(第8天)，HR類和MR類油菜綠肥品種的平均發芽率無顯著差異，卻分別較LR類油菜綠肥(84.1%)高出16.5% (P< 0.05)和13.7% (P<0.05)。

圖2 第1、4、8天3個耐旱級別油菜綠肥在對照和干旱脅迫條件下的發芽率(a)和第8天3組典型油菜綠肥品種實際發芽情況(b)Fig. 2 Average germination rates (a) of the three drought-resistant Brassica green manure groups under normal water and drought stress conditions on the 1st,4th,and 8th days of germination and germination images (b)of a typical Brassica green manure variety from each group on the 8th day

圖3 不同抗旱級別油菜綠肥在對照和干旱脅迫條件下的苗期表現Fig. 3 Seedling performance of different drought-resistant Brassica GM groups under control and drought stress conditions

無論是抗旱能力強還是抗旱能力弱的綠肥品種，干旱脅迫環境下參試油菜綠肥苗期的根長和根芽比較對照均顯著增加，增幅分別為39.2%～86.7%(平均52.7%)和86.1%～121.9% (平均96.6%)；而芽長和單株鮮重均顯著低于對照處理，降幅分別為16.6%～25.3% (平均21.4%)和31.1%～40% (平均36.6%) (圖3)。平均來看，3類油菜綠肥材料苗期除芽長無顯著差異外，HR類17份油菜綠肥材料在苗期與MR類和LR類相比具有較高的根長、單株鮮重和根芽比，增幅分別為10.5%～26.5%、11.4%～13.3%和14.5%～21.5% (P< 0.05)；此外，MR類綠肥材料苗期根長較LR類增加14.4% (P< 0.05)。

3 討論

干旱是制約作物生長發育的主要非生物因素之一，要篩選抗旱性的材料，選擇合理的篩選方法至關重要。大田抗旱性鑒定是最直接有效的方法，但存在試驗周期長且受環境條件制約性較大、重復性不高的問題。在人工控制或模擬干旱條件研究的各種方法中，聚乙二醇(PEG-6000)滲透脅迫法具有簡單易行、條件容易控制、重復性好且試驗周期短的特點[14]。PEG溶于水后既能產生強大的滲透壓，使植物組織和細胞處于類似于干旱的水分脅迫之中，又因其分子量大，不能穿越細胞膜進入細胞質，不會傷害植物[14-16]。自1979年以PEG作為誘導劑和篩選劑篩選出抗旱的煙草細胞系后，由于其無毒的特點，PEG作為模擬土壤干旱環境的理想滲透劑廣泛應用于水稻[17]、小麥[18]、玉米[19]、紫花苜蓿[20]等作物種子萌發以及幼苗階段抗旱性鑒定研究。符明聯等[21]研究表明用PEG- 6000模擬干旱脅迫處理篩選油菜抗(耐)旱材料是可行的，其結果與大田脅迫試驗篩選具有較好的一致性。

本試驗采用10% PEG-6000模擬干旱脅迫對30份油菜綠肥品種進行了苗期抗旱性研究，結果表明10% PEG-6000干旱脅迫能顯著抑制油菜綠肥幼苗的生長，供試油菜的芽長和鮮重等指標較對照均顯著下降，而根長和根芽比顯著增加，發芽率有提升的趨勢但差異不顯著，這與其他相關研究的報道[14,22]結果基本一致。涂玉琴等[23]采用10% PEG-6000模擬干旱脅迫的方法，對41份來源于甘藍型油菜與菜屬間雜交獲得的穩定高世代品系和32份甘藍型油菜品種進行苗期干旱脅迫模擬，研究表明PEG模擬干旱脅迫后大部分材料成苗率降低，苗高、苗鮮重和活力指數普遍降低，而根長則明顯增加。董小云等[24]采用不同質量分數的PEG-6000溶液模擬水分脅迫，研究發現PEG對4種白菜型冬油菜的成苗率、主根長、苗高、單株鮮質量、相對活力指數均有顯著的抑制效應。本研究中，PEG-6000模擬干旱脅迫促進了油菜綠肥種子根系的生長，但對油菜芽長和芽鮮重均沒有表現出促進作用，這是因為油菜種子在萌發和生長過程中一旦感受到干旱脅迫，會通過改變其葉片和根系的形態以響應干旱脅迫[25]。油菜葉片作為進行光合和蒸騰作用的重要器官，輕度的水分虧缺會引起其生長顯著變慢、葉面積降低，進一步引發植物光合作用減慢、地上部干物質積累降低，最終導致其生長速度減慢甚至停滯[26]。作物根系對抵抗干旱脅迫具有至關重要的作用[25]。在輕度干旱脅迫下，植物根系最先感受到土壤水分的減少，并通過改善根系形態(例如，增加側根數、深層根數量和根系長度等)來提高根系活力，旨在從周圍環境中吸收更多的水分[27]。這不僅是植物適應缺水環境的一種表現，同時也是植物應對干旱脅迫的一種適應性反應。根冠/芽比為根系與地上部生物量(干/鮮)的比值，其數值大小能夠反映出植物地下部分與地上部分是否同步變化[28]。干旱脅迫條件下，根系一方面產生信號物質向地上部分運輸，另一方面將繼續生長以擴大水分的吸收面積；植物地上部通過調節氣孔開度以減少水分散失，同時將葉片光合產生的碳水化合物更多向根系分配以保證根系生長，地上部生長則會受到抑制，最終促使作物的根冠比升高[29]。Gao等[30]研究認為，根系的功能制約著作物冠層的發育與資源利用效率，干旱條件下協調作物根冠平衡，最大程度地發揮根系和葉片的功能，才能維持正常生長以及保證產量。

綠肥種子抗旱性是受多種因素影響的復雜數量性狀，用單一指標進行抗旱性能評價難以全面反映出植物真實的抗旱能力[31]。因此，采用多指標的綜合鑒定評價，其結果更加真實有效。本研究采用隸屬函數、灰色關聯度分析、綜合抗旱指數和系統聚類分析相結合的方法對旱地油菜綠肥苗期抗旱性進行全面評估，結果表明此綜合分析方法能夠較好地揭示種子萌發特性與抗旱性的相互關系，其中油菜綠肥種子的萌發指數、相對活力指數和根長與綜合抗旱指數的關聯性更為密切。符明聯等[11]研究發現，利用隸屬函數法可對干旱脅迫下58份甘藍型油菜和芥菜型油菜的種間雜交后代的多個性狀進行定量綜合分析，以消除個別性狀指標的片面性，使品種間的抗旱性差異具有可比性。朱宗河等[32]利用主成分分析、隸屬函數分析和聚類分析對甘藍型油菜耐旱性進行分類和綜合評價，研究認為可篩選出甘藍型油菜耐旱種質。謝小玉等[13]將綜合抗旱指數和干旱脅迫下的8個指標視為一個整體，利用灰色關聯度分析進行油菜抗旱性評價，結果顯示灰色關聯分析和抗旱性度量值分析有較強的一致性，可以較好地揭示指標性狀與抗旱性的關系，同時推薦該方法也可用于其它作物的抗旱性評價。趙陽佳等[33]對油菜、紅三葉、田菁、黑麥草、紫云英、毛葉苕子和白三葉7種綠肥作物進行了種子抗旱萌發試驗，并利用模糊隸屬函數法進行抗旱能力的綜合評價，結果表明油菜和黑麥草綠肥種子萌發期的抗旱性強于其他綠肥作物，認為適宜在北京地區推廣種植。本研究中參試的30份油菜綠肥品種在外界干旱脅迫時能通過關鍵生理指標的變化(例如：增加根長和根芽比、促進發芽等方式)來及時響應，建議在后期篩選適宜在黃土高原干旱區種植的其他綠肥品種時應著重關注以上生理指標的變化規律。同時，考慮到室內模擬條件和田間自然環境還存在一定的差異性，后續還需要在田間自然條件下對已篩選出的抗旱能力較強的油菜綠肥品種的抗旱性做進一步綜合評價，同時在提升油菜綠肥苗期抗旱能力等方面進行更深入的機理研究。此外，萌發期抗旱性較強的油菜綠肥種子是否在苗期乃至整個生育期也具有較強的抗性？前期抗旱能力較差的油菜綠肥種子在后期生長過程中能否提高抗旱性能？其相關內容還有待進行油菜綠肥苗期和全生育期的進一步研究。

4 結論

油菜綠肥種子萌發指數、相對活力指數和根長與其綜合抗旱指數關聯較為密切，而鮮重和根芽比與其關聯度較弱。總體來看，抗旱能力較強的油菜綠肥在遭遇外界干旱時能通過自身較高的發芽率，增加根系長度，提高根芽比應對干旱脅迫環境帶來的不利影響。因此，這3個指標可以用來評價油菜綠肥品種抗旱性的強弱。30個供試綠肥油菜品種中有17個品種因其苗期較強的萌發特性和抗旱能力，適宜在黃土高原旱作區推廣種植。