超聲提取廣西白木香葉黃酮的工藝研究

蘇偉雄

515300廣東省普寧市中醫醫院藥學部，廣東普寧

資料與方法

實驗所使用的材料為白木香葉，取材所用白木香來自于廣西的沉香種植園，經定種確定為白木香，取葉于實驗室條件下洗凈晾干，剪碎后以粉碎機打成粗粉，以50℃烘干15 min后混勻過60目篩。

試劑：無水乙醇、醋酸鈉、乙酸鈉與蘆丁標準品。

儀器：除實驗室常用儀器外，本文所使用的主要儀器見表1。

表1 實驗主要儀器

方法：實驗首先構建標準曲線，然后通過重復實驗測定方法的有效性，最后進行正交實驗。①構建標準曲線，精密稱取20 mg蘆丁標準品，以60%乙醇轉移至10 mL 容量瓶中并仔細沖洗，使用60%乙醇定容，顛倒多次使之均勻，形成標準液。精密吸取0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL標準液于試管中，逐個加入2 mL 0.1 mol/L AlCl3，3 mL 1 mol/L 醋酸鈉和5 mL 60%乙醇，于室溫下反應20 min，以60%乙醇轉移至10 mL容量瓶中并定容，分別于分光光度儀450 nm 波長下測定吸光度從而構建標準曲線。②構建提取方法，準確稱取1 g白木香葉過篩干粉，置于50 mL離心管中，加入一定濃度和體積的乙醇，置于超聲波粉碎儀，設定超聲工作模式，即5 s超聲與靜置交替，功率50 W，持續工作一段時間后取出冷卻，6 000 r/min離心20 min后取上清液，于分光光度儀450 nm 波長下測定。測定結果根據標準曲線計算獲得對應總黃酮含量。③進行精密度測試、重復性測試、加樣回收與正交實驗。正交實驗的條件設置見表2。

表2 正交實驗條件

結果

標準曲線：實驗測定結果顯示蘆丁濃度與吸光度結果見表3。

表3 蘆丁濃度與吸光度間的關系

基于此，則可相應繪制標準曲線，其標準曲線見圖1。

圖1 標準曲線

如上表所示，標準曲線函數為y=0.259x+0.385，R2=0.994，基于此，可以進一步測定待測白木香葉中的總黃酮含量，從而對其進行提取工藝優化。

精密度實驗：精密度測試結果見表4。

如表4所示，平行實驗下不同樣本的標準差普遍較小，顯示出超聲提取法的方法穩定性相對較高，實驗方法的精密度較高，方法可靠性良好。

表4 精密度測試結果

重復性實驗：重復性測試結果見表5。

表5 重復性測試結果

重復性實驗中超聲提取法有著相對較低水平的標準差和較低水平的相對標準差，總體上重復性實驗表現相對較好，顯示出重復性測試自身的穩定性，能夠得到更為穩定的檢測結果。

加樣回收實驗：加樣回收實驗結果見表6。

如表6所示，加樣回收的結果穩定性極高，全部加樣回收實驗測定的回收率均圍繞著98.4%上下波動，波動幅度極小，不同稱樣量下的相對標準差高度接近，顯示出方法良好的穩定性和回收率。

表6 加樣回收實驗結果

正交實驗：正交實驗的測定結果，見表7。

如表7所示，不同濃度乙醇對測定結果的影響顯著，60%濃度乙醇顯著表現出較好的提取率，不同條件下實驗測定總黃酮類物質平均提取率可以達到4.9%。稍高或稍低于60%濃度的乙醇的提取率均有著較大差異，而與此同時，60%濃度的乙醇提取方法也表現出了最低水平的相對標準偏差，進一步驗證了這一方法的有效性和穩定性。見表8。

表7 不同濃度乙醇測定結果整理

如表8 所示，不同料液比對測定結果的影響顯著，25 mL乙醇∶1 g白木香葉過篩干粉顯著表現出較好的提取率，不同條件下實驗測定總黃酮類物質平均提取率可以達到5.07%。稍高的料液比同樣能夠取得較高的提取率，30 mL乙醇∶1 g白木香葉過篩干粉仍然能夠達到平均5.01%的提取率，整體而言料液比的影響較為顯著，在剔除料液比變化的條件下，不同乙醇濃度與不同超聲處理時間累積形成的相對標準偏差普遍較低。見表9。

表8 不同體積乙醇測定結果整理

如表9所示，不同超聲處理時長對于測定結果影響顯著，20 min 的處理時長顯著表現出較好的提取率，不同條件下實驗測定總黃酮類物質平均提取率可以達4.89%。

表9 不同超聲處理時長測定結果整理

累積考慮不同影響因素，全部正交實驗結果中的最高平均提取率60%乙醇25 mL∶1 g白木香葉，過篩干粉經20 min 超聲處理后所獲得的提取率是5.62%，該提取率為最高值，符合各類正交實驗分類測定對比結果形成的最佳工藝條件。

討論

白木香又稱沉香，是我國傳統中藥材。沉香取自其具樹脂的莖，白木香葉非傳統入藥部位，較少得到研究者關注。白木香葉中的天然活性成分較多，主要為總黃酮類物質，其與沉香的結香過程密切聯系，從而得到了較多研究與討論。

中藥材中，沉香多來自于我國西南地區與東南亞地區，而國產沉香則為桃金娘目瑞香科，沉香屬白木香，種于廣州和云南部分地區，稱白木香，于廣東地區又稱女兒香、芫香，于《海南植物志》稱香材，于《中國植物志》稱土沉香，于《本草綱目拾遺》稱棧香，于《名醫別錄》稱沉香。白木香老莖受傷產出的樹脂稱沉香，可作香料。

相較于沉香，白木香葉并非白木香的傳統藥用部位，相應化學成分分析和藥用價值研究相對較少。梁林源和甘超勝(2019)采用文獻研究、訪談法和野外調查法等方法調查、了解了野生白木香葉中的黃酮類物質，對其研究現狀進行綜述，對其抗癌活性進行實驗測定。汪元元等[1](2019)對白木香葉相關領域的研究進展進行了綜述，對其化學成分及其所具有的藥理價值分別進行了分析與討論，并從活性化學成分、提取工藝優化等角度分別進行了綜述。

本文構建了白木香葉中總黃酮的超聲提取方法，實驗測定形成標準曲線而使得實驗人員能夠基于這一方法與標準曲線測定樣本白木香葉中的黃酮含量。精密度實驗顯示其多組平行試驗的結果，標準差僅為0.000 35；重復性實驗的標準差與相對標準偏差擴大，說明需要經過重復性實驗以穩定實驗結果；加樣回收實驗顯示出實驗方法高度穩定，相對標準偏差約為0.001 7。

黃酮類物質自身屬于植物常見的次生代謝產物，包含黃酮、黃酮醇、異黃酮、鞣酐、原花青素、花色素和橙酮等，普遍以苯丙氨酸為共同前體，與結香過程中的抗逆性密切聯系，因而在代謝過程和提取工藝方面普遍有著較高的相似性，總稱黃酮類物質。大量先行研究對超聲提取黃酮類物質的測定方法進行了多樣化的研究。黃靖等[2]對福建佛手采用超聲提取總黃酮的工藝進行了分析，測定采用60%濃度乙醇與料液比1∶35 提取方式取得最高提取率。肖牧原[3]對于超聲提取薄荷總黃酮工藝進行了優化，測定采用41.14%濃度乙醇與21.57∶1料液比能夠獲得最大提取效率。鄒維等[4]對超聲聚能醇鹽雙水相提取藜麥中的總黃酮工藝進行了分析，測定采用固液比28∶1與醇水體積比0.9∶1為最佳條件。王志偉等[5]對超聲輔助提取三七花總黃酮工藝進行了優化，測定采用73%濃度乙醇與料液比1:40提取方式取得最高提取率。

綜上，有關于植物中黃酮類物質超聲提取的相關工藝研究與分析數量較多。所采用的超聲提取工藝多為醇提法，使用固液比和醇水比普遍較大。對比而言，白木香葉所采用固液比較小而乙醇濃度較低，主要來自于白木香為革質葉而使醇提法需水量增長。