黑曲霉轉化系統的優化及重組菌株高效篩選

李岑,劉松*,堵國成

1(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

在傳統發酵食品中,黑曲霉(Aspergillusniger)具有悠久的應用歷史。美國食品與藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)已認定黑曲霉生產的多種酶制劑和有機酸為公認安全(Generally Regarded As Safe,GRAS)等級[1]。黑曲霉在工業生產中除了具有食品安全性的特性,同時還具備高生產經濟性、極端環境耐受性、強發酵魯棒性等優點[2]。GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中,44%的酶制劑使用黑曲霉發酵生產,包括應用于烘培食品中的天冬酰胺酶(asparaginase,ASN,EC,3.5.1.1)[3]。為了進一步開發黑曲霉細胞工廠用于表達重組蛋白,分子手段理性改造黑曲霉宿主成為研究熱點[4]。

黑曲霉與大腸桿菌、枯草芽胞桿菌等工業表達宿主相比,生長周期更長,生長和生殖方式更復雜。這些生理特性使黑曲霉分子操作更加耗時耗力,且菌株之間也存在轉化方式和條件的差異[5]。轉化效率低下不僅消耗大量的勞力和物力,而且阻礙黑曲霉菌株的進一步開發。CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein(Cas))基因編輯系統在黑曲霉中的應用需要以高效的轉化系統為前提。因此,構建高效的轉化系統對于黑曲霉菌株開發至關重要。目前,電轉化、農桿菌介導法(Agrobacteriummediated transformation,AMT)和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介導轉化法(Agrobacterium-mediated and PEG-mediated transformation,PMT)是黑曲霉中常用的轉化方法[6]。3種轉化法中,以電轉化最簡便和快捷,黑曲霉MGG029-△aamA電轉化能產生50個轉化子/μg DNA[7],然而,絲狀真菌電轉化的轉化效率通常較低[8]。AMT利用農桿菌與黑曲霉共培養,使轉化步驟和周期增加,該方法雖然能提高外源基因同源重組的效率[9],但外源基因在基因組上形成的拷貝數低[10],黑曲霉CICC2462[11]和CICC2169[12]使用AMT進行重組蛋白表達。PMT在黑曲霉中的應用最多,實驗室標準菌株N402及其衍生菌株均使用PMT轉化[13]。原生質體的制備是提高PMT效率的關鍵[6],通過優化菌絲酶解的體系和條件能提高原生質體濃度[14]。因此,篩選適合宿主的轉化方法,并系統地優化轉化關鍵步驟,提高轉化效率有利于CRISPR-Cas基因編輯系統在黑曲霉中的應用。

CRISPR-Cas基因編輯系統在不缺失非同源重組基因kusA的黑曲霉菌株中,也能進行高效的同源重組[15]。黑曲霉轉化子的純化步驟是耗時的[16],陽性轉化的獲得約需要2周時間[15]。為了快速篩選里氏木霉陽性轉化子,利用目的基因與綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合,再結合流式細胞儀(flow cytometer,FCM)分選技術,已構建了基于熒光強弱快速篩選高表達目標基因的單孢子平臺[17]。因此,以GFP為報告基因,利用FCM可實現熒光孢子的快速分選。

本研究針對黑曲霉AG11,考察電轉化、AMT和PMT對外源基因轉化效率的影響,系統優化PMT中的關鍵步驟,以期顯著提高轉化效率。利用CRISPR-Cas9技術,將融合GFP的ASN基因整合至黑曲霉AG11糖化酶位點,并通過流式細胞儀分選表達ASN的孢子。研究結果將為黑曲霉基因編輯提供重要的基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

黑曲霉AG11(CCTCC M 2018881)、大腸桿菌JM109、米曲霉NRRL3488、質粒pAN7-1、pUC57和pET-22b(+)/S1-gfp[18],實驗室保存。質粒pCAMBIA1301編碼潮霉素基因,淼靈質粒平臺；pFC332(Addgene質粒#87845)編碼密碼子優化的釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9基因和潮霉素基因,Addgene。

1.1.2 試驗試劑

PrimerSTAR Hs DNA聚合酶、Yatalase、反轉錄試劑盒(Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser)、定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTMTli RNase H Plus),TaKaRa公司；溶解酶,廣東省微生物菌種保藏中心；幾丁質酶、溶壁酶、葡萄糖醛酸酶,Sigma公司；潮霉素、質粒提取試劑盒,上海生工公司；ClonExpress Ultra一步克隆試劑盒,南京諾唯贊公司；植物基因組提取試劑盒、植物RNA總提取試劑盒,天根公司；其他常規試劑及藥品為國產或進口分裝。

1.1.3 培養基與緩沖液

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨 10,酵母提取物 5,NaCl 10。篩選平板中添加50 μg/mL硫酸卡那霉素或者100 μg/mL氨芐青霉素。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基(g/L)：馬鈴薯 200,葡萄糖 20。

ME培養基(g/L)：蔗糖 20,麥芽提取物 5,ZnSO4·7H2O 0.001,CuSO4·5H2O 0.000 5,pH 5.5。

改良察氏培養基(modified Czapek-Dox,MCD)(g/L)：蔗糖 20,麥芽糖 10,NaNO33,K2HPO41,MgSO40.5,KCl 0.5,FeSO40.01。作為轉化平板時蔗糖添加量為342.3 g。

種子培養基(g/L)：玉米漿 30、精制黃豆粉 20、玉米淀粉 20、葡萄糖 5,pH 6。

發酵培養基(g/L)：玉米漿 30、精制黃豆粉 20、玉米淀粉 20、麥芽提取物 30、天冬酰胺 10,pH 6。

以上固體培養基中添加15～20 g/L的瓊脂。

KMC緩沖液：50 mmol/L CaCl2,20 mmol/L 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸。

STC緩沖液：1.2 mol/L山梨糖醇,10 mmol/L CaCl2,10 mmol/L Tris,pH 7.5～8。

PEG緩沖液：250 g/L PEG,50 mmol/L CaCl2,10 mmol/L Tris,pH 7.5～8。

磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)(g/L)：NaCl 8,KCl 0.2,Na2HPO41.44,KH2PO40.24,pH 7.4。

磷酸鹽緩沖液：0.1 mol/L KH2PO4-K2HPO4,pH 7.5。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉化質粒和片段的構建

PCR片段使用ClonExpress Ultra一步克隆試劑盒組裝后在大腸桿菌JM109中進行構建。根據表1中的引物,以質粒pAN7-1為模板用引物HyhB-F/HyhB-R擴增潮霉素基因表達框片段用于轉化AG11。

如圖1-b所示,由煙曲霉u3 snRNA啟動子和終止子[19]、tRNAGly[19]與靶向glaA基因的gRNA組成的gRNA表達框由南京金斯瑞合成并克隆至pUC57載體,以此質粒為模板,用引物P57-F/P57-R進行gRNA表達框擴增用于黑曲霉轉化。靶向glaA的目標序列為CATCCTGAATAACATCGGGG。

以黑曲霉AG11基因組為模板用引物Uppy-F/Uppy-R和Dopy-F/Dopy-R分別擴增pyrG基因(GeneID：4985706)上游和下游片段。以pUC57質粒為模板,用引物Tp57-F/Tp57-R擴增載體片段,以上3個片段通過一步克隆試劑盒組裝成含有pyrG敲除片段的質粒。以此質粒為模板,pyrG敲除片段通過引物對P57-F/P57-R擴增用于轉化。

圖1 黑曲霉CRISPR-Cas系統的轉化質粒/片段Fig.1 Transformation plasmid/fragments of CRISPR-Cas system into A.niger

以黑曲霉AG11基因組為模板用引物對Pgla-F/Pgla-R、Tgla-F/Tgla-R、A1-F/A1-R、A2-F/A2-R和A3-F/A3-R分別擴增GlaA啟動子片段(包括GlaA信號肽,SPgla)、GlaA終止子片段、ASN基因ASN-1(GeneID：4989881)、ASN-2(GeneID：37096104)和ASN-3(GeneID：37104124)。以米曲霉NRRL3488基因組為模板用引物Aopy-F/Aopy-R擴增pyrG表達框(AopyrG)。以pET-22b(+)/S1-gfp為模板用引物GFP-F/GFP-R擴增GFP片段。以pUC57質粒為模板用引物Tp57-F/Tp57-R擴增載體片段。以上片段經一步克隆試劑盒如圖1-c中供體DNA片段順序進行組裝得到3個攜帶不同ASN基因的質粒。以這些質粒為模板用Tp57-F/Tp57-R擴增供體DNA片段用于轉化黑曲霉。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 黑曲霉轉化

在MCA平板中分別添加50、100、150、200、250、300、350 μg/mL潮霉素和0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL的5-氟乳清酸對AG11菌株進行梯度抗性耐受性試驗。黑曲霉AG11于PDA平板30 ℃培養4～7 d后收集新鮮孢子。電轉化使用生長4 d的孢子,2 h萌發后在5 kV/cm的電場強度[7]中與10 μg潮霉素基因表達框片段進行轉化。使用凍融法將質粒pCAMBIA1301轉入農桿菌AGLI,農桿介導轉化的條件為使用OD600為0.9～1.0的農桿菌陽性轉化子與生長5 d的黑曲霉AG11孢子,23 ℃共培養48 h后轉膜[20-21]。生長7 d的新鮮孢子接種于裝有10% ME培養基的250 mL搖瓶中培養32 h,收集0.1 g菌絲用于原生質體制備。菌絲在復合酶液(5 mg/mL溶壁酶、0.2 U/mL幾丁質酶和460 U/mL葡萄糖醛酸酶[14]溶于10 mL KMC緩沖液)30 ℃,120 r/min振蕩酶解2 h后,使用過濾膜進行過濾,離心棄上清液后用10 mL預冷的STC洗滌2次原生質體。100 μL原生質體與10 μg轉化片段/質粒在PEG緩沖液中混勻,冰上放置25 min后,再加入PEG緩沖液于室溫倒至含抗性的轉化MCA平板中[14]。轉化平板置于30 ℃培養箱5～7 d后挑取單菌落進行轉化子傳代純化。黑曲霉菌株基因組參照植物基因組提取試劑盒說明書進行。以轉化子基因組為模板用相應的驗證引物對(表1)擴增目標基因序列,并在蘇州金唯智公司進行測序驗證。

在以上初始的PMT基礎上進行轉化條件優化,優化原生質體制備的條件依次包括使用酶的種類(初始條件中的復合酶和Yatalase、溶解酶進行比較)、酶解溫度(20～40 ℃)、酶解時間(0.5～3.5 h)、酶解緩沖液pH(3～8)、菌絲干重(0.2～1.4 g)、菌絲生長時間(24～84 h)和菌絲球直徑(0.1～0.5 cm)。PMT過程優化的條件包括PEG的種類(PEG 2 000、4 000、6 000和8 000)和Ca2+濃度(10～50 mmol/L)。

1.2.3 FCM分選黑曲霉單孢子

使用PBS洗下MCD轉化平板上生長5 d的黑曲霉孢子,使用膜過濾后離心收集孢子,用2 mL PBS重懸2次,稀釋孢子液OD至0.3～0.5上FCM進行熒光檢測。AG11的孢子懸液樣品作為陰性對照,樣品由FITC-Log通道檢測。預先在48孔板中加入2 mL固體MCD培養基,熒光信號強的單孢子被分選入單獨的孔中,分選結束后孔板置于30 ℃培養4～6 d。

1.2.4 黑曲霉搖瓶發酵

取48孔板單孔中黑曲霉的孢子涂布于PDA平板30 ℃培養7 d制備孢子懸液,接種500 μL的107個/mL新鮮孢子菌懸液于含有10%種子液培養基的250 mL搖瓶中。發酵24 h后以10%的接種量轉接至含有30 mL發酵培養基250 mL搖瓶中發酵48 h進行目的基因的實時熒光定量PCR分析；發酵72 h測定ASN酶活力。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析

黑曲霉48 h發酵液離心棄上清液,菌體用PBS沖洗2次,離心收集菌體用液氮研磨至細粉狀,參照植物RNA提取試劑盒說明書提取RNA。使用反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。以相應菌株的cDNA為模板,使用引物對GF-RT-F/GF-RT-R和A3-RT-F/A3-RT-R分別對GFP和ASN-3基因進行實時熒光定量PCR分析,操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.6 ASN酶活力測定

取發酵上清液100 μL與200 μL天冬酰胺(0.15 mol/L)、900 μL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L)混合,37 ℃孵育30 min,用Nessler試劑測定氨的釋放量[22]。ASN酶活性單位定義為:在測定條件下1 min釋放1 μmol/L氨的酶量。菌絲液氮研磨破碎后用于胞內酶活力測定[23]。

2 結果與分析

2.1 轉化方法對黑曲霉AG11轉化效率的影響

抗性結果表明,潮霉素對AG11的最小抑制質量濃度為300 μg/mL,而5-氟乳清酸對AG11的致死質量濃度為2 mg/mL。通過以上濃度選定轉化平板中抗性的添加量。

黑曲霉的3種主要轉化方法包括電轉化法、AMT和PMT[6]。利用這3種方法分別將潮霉素基因轉入AG11,對比AG11中的轉化效率和外源基因的遺傳穩定性(圖2)。

圖2 三種轉化法在黑曲霉AG11中的轉化效率對比Fig.2 Comparison of transformation efficiency of three transformation methods in A.niger AG11

如圖2所示,AMT和PMT獲得了轉化子,而多次電轉均未在抗性平板上獲得轉化子。將AMT和PMT初級轉化平板上所得轉化子經過3輪的傳代純化后,檢驗外源基因的傳代穩定性。結果顯示,潮霉素抗性片段在PMT產生的轉化子中穩定性良好,而在農桿菌介導轉化子中丟失嚴重,假陽性高。因此,選擇PMT用于AG11的轉化。由于PMT產生的轉化子較少,轉化效率仍需提高用于CRISPR-Cas9系統在AG11中的構建。

2.2 PMT的系統優化

制備原生質體是進行高效PMT的關鍵步驟[10]。酶制劑[10]和菌絲體的生長狀態對原生質體的釋放有顯著的影響。因此,本研究從影響酶制劑活性的因素(酶的種類、溫度、時間和酶解緩沖液pH)和黑曲霉菌絲生長狀態的因素(菌絲生長時間、干重和菌絲球直徑)對原生質體制備的條件進行優化。

如圖3-a所示,在初始轉化條件下,對比酶制劑酶解效果的差異,Yatalase釋放最多的原生質體,比復合酶釋放的原生質體個數提高了約9倍,達9×105/mL。由于初始的酶解溫度和緩沖液pH處于較優的狀態,因此,優化這2個因素原生質體濃度無顯著提升(圖3-b、圖3-c)。如圖3-d所示,酶解時間延長至2.5 h使原生質體釋放量增加,其濃度大于106/mL使轉化效率得到明顯提升。但是,酶解時間過長(>3 h)會導致原生質體在酶解液中破裂,應及時處理酶解好的原生質體。10 mL酶解液的適宜添加量為0.8～1 g菌絲,較初始條件約提高8.3～8.9倍,最高達8.9×106/mL(圖3-e)。菌絲生長至48～72 h適于制備原生質體(圖3-f),而早期的原生質體表現出更高的轉化效率和活力。最后,菌絲的直徑也會影響原生質體的制備效率,直徑大(0.3～0.5 cm)松散的菌絲球比直徑小(0.1～0.2 cm)緊實的菌絲球更易被酶解。

a-酶制劑；b-酶解溫度；c-酶解緩沖液pH；d-酶解時間；e-菌體干重；f-菌體生長時間圖3 黑曲霉AG11原生質體制備條件優化Fig.3 Optimization of protoplast preparation conditions of A.niger AG11

在PMT中,Ca2+介導外源DNA作為信號分子進入細胞質,而PEG的作用可能是負責協助外源DNA進入細胞質后的釋放[24]。因此,針對PEG的種類和緩沖液中Ca2+濃度進行優化。然而,通過對比發現,所選PEG的種類和Ca2+濃度對轉化效率的影響不顯著。

在黑曲霉AG11的PMT中,原生質體的濃度對轉化效率影響最顯著。優化原生質體制備的條件下進行PMT轉化,能產生90個轉化子/μg DNA,陽性率達80%以上。

2.3 GFP單孢子分選及ASN在黑曲霉中的表達

參考黑曲霉CBS513.88基因組中的基因注釋[25],從黑曲霉AG11菌株基因組中獲得ASN-1(GeneID：4989881)、ASN-2(GeneID：37096104)和ASN-3(GeneID：37104124)3個ASN基因。為了將ASN與GFP融合表達的供體DNA片段(圖1-c)轉化AG11。在AG11中轉化pyrG敲除片段,并利用含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的轉化平板,構建AG11△pyrG菌株。利用CRISPR-Cas系統(圖1),供體DNA在AG11△pyrG菌株的glaA位點進行同源重組效率約為30%。收集AG11和轉化平板上的孢子,使用FCM進行熒光強度分析。以AG11為陰性對照,只有ASN-3基因與GFP融合時檢測到熒光信號(圖4-b),在熒光顯微鏡下也能觀察到孢子之間的熒光差異(圖4-a)。FCM分析ASN-3基因與GFP融合轉化平板上的30萬個孢子,0.3%的孢子能表達GFP。分選后的單孢子在48孔板上存活率達65 %(圖4-c)。隨機挑選48孔板中的菌絲在熒光顯微鏡下進行觀察,孔板中的菌絲均觀察到GFP表達,而AG11菌絲中無熒光信號(圖4-d)。為了進一步驗證目的基因ASN-3能通過FCM進行精準分選,需要對48孔板中菌株ASN的表達情況進行驗證。

a-轉化子孢子表達GFP在激發光下產生綠色熒光,左圖為明場拍攝,右圖為藍光場拍攝；b-黑曲霉孢子利用FCM分選,ASN-GFP：ASN-3與 GFP融合表達轉化子；c-分選熒光孢子在48孔MCA板中生長60 h；d-黑曲霉菌絲在激發光下菌絲熒光對比圖,菌株1和菌株2為48 孔板單孔隨機挑選菌株,第一行圖為明場拍攝,第二行為藍光場拍攝圖4 FCM分選黑曲霉GFP單孢子Fig.4 Flow cytometry sorting of GFP spore of A.niger

隨機挑選48孔板中生長的6個菌株進行發酵,以驗證ASN-3和GFP基因的轉錄水平和ASN表達情況。如圖5所示,ASN-3基因和GFP基因在AG11菌株中無轉錄水平,而在分選的6個菌株中ASN-3和GFP的轉錄水平明顯提高,說明2個基因的在6個菌株中均成功轉錄。此外,菌株1～6的胞外和胞內均檢測到ASN活性,菌株5胞外ASN酶活力為0.6 U/mL。綜合圖4和圖5的結果表明,在黑曲霉中利用GFP與目的基因融合,基于轉化平板中孢子熒光強弱的差異,構建快速篩選重組單孢子的方法簡單而有效。

3 結論與討論

黑曲霉菌株改造過程中,由于轉化子需要多輪次純化,分子操作費時費力[6],且菌絲形態阻礙了菌株篩選的高通量。因此,黑曲霉工業菌株主要采用誘變的手段進行改造。然而,隨著模式黑曲霉菌株組學信息的公布,其中新基因簇的發現、與酶分泌和形態學調控相關基因的挖掘為研究者理性改造菌株提供了更多的方向和思路[25]。提高黑曲霉菌株編輯效率和重組菌株篩選效率將簡化和促進黑曲霉宿主的優化。

a-GFP和ASN-3基因轉錄水平；b-胞內胞外ASN酶活力； 菌株1～6為48孔板單孔生成菌株圖5 FCM分選GFP單孢子生成菌株的ASN表達驗證Fig.5 Asparaginase expression verification of GFP spore strains sorted by flow cytometry

本研究以前期篩選的黑曲霉優良表達宿主AG11為出發菌株,基于已報道的最佳轉化條件,在AG11中比較電轉化、AMT和PMT的轉化差異,以PMT的轉化陽性率最高。對PMT中原生質體的制備進行了優化,使得0.8～1 g松散的菌絲球于10 mL Yatalase溶液(0.8 mg/mL,pH 5.5)反應2.5 h原生質體釋放量達8.9×106個/mL。以此高濃度、高活力的原生質體進行轉化,轉化效率較優化前提高14倍,獲得90個轉化子/μg DNA,陽性率達80%以上。基于構建高效轉化系統的基礎上,利用CRISPR-Cas9基因編輯系統將ASN與GFP融合表達框同源整合至黑曲霉AG11糖化酶位點。以GFP為報告基因,通過FCM分選確認ASN-3基因在黑曲霉中成功表達,其中,0.3%的孢子能表達GFP(共篩選30萬個孢子),65%表達熒光蛋白的孢子能表達ASN,胞外ASN酶活力為0.6 U/mL。構建的此篩選的方法能高效分選出重組黑曲霉菌株,省去了轉化子挑選和傳代純化的步驟,節約了時間和勞動力。研究結果將為黑曲霉基因編輯和重組菌株的快速篩選提供重要方法學基礎。

基于FCM分選技術構建快速篩選黑曲霉重組孢子方法,所檢測的目的基因表達水平仍處于孢子水平。然而,孢子生成菌絲后,目的基因在其中的表達和分泌還受到蛋白分泌途徑和菌絲形態的調控。因此,為了檢測目的基因在菌絲中的分泌差異,需要構建更精細的篩選技術的來分選黑曲霉菌絲。建立高效的黑曲霉微流控高通量篩選技術將是下一步研究的主要內容。