產功能性胞外多糖及DL-乳酸的植物乳桿菌的高效發酵和應用

衛津宇,陳東,李程程,史仲平*

1(江南大學 生物工程學院,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122) 2(南京林業大學 輕工與食品學院,木質纖維功能材料國際聯合研究實驗室,江蘇 南京,210037)

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是一種可以生產多種有益物質的功能性乳酸菌,其自身可用做食品發酵劑。植物乳桿菌在生長代謝過程中為適應環境會形成乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides,EPS),它們有的分泌到培養基,形成黏液多糖；有的依附于細胞壁上,稱為莢膜多糖[1]。乳酸菌胞外多糖按照單糖組成,可以分為同型多糖(homopolysaccharide,HoPS)和異型多糖(heteropolysaccharide,HePS)。HoPS只包含一種單糖(葡萄糖或果糖),他們在糖苷鍵、分支、鏈長、相對分子質量和聚合物結構方面有所不同。與HoPS相比,HePS的生物合成及其結構更為復雜。HePS由不同單糖的重復單元組成,包括葡萄糖、半乳糖和鼠李糖,偶爾含有N-乙酰-D-葡萄糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、糖醛酸和一些非碳水化合物取代物如丙酮酸、乙酸、磷酸鹽和琥珀酸,這些物質在生理和工藝中發揮關鍵作用[2]。研究表明,植物乳桿菌EPS可以改善奶酪和酸奶等發酵乳制品的質構和流變性,作為增黏劑、乳化劑、膠凝劑或穩定劑廣泛應用于乳制品行業[3-4]。除了能改善發酵食品特性,植物乳桿菌EPS還能夠增強人體免疫力,促進人體健康,具有降血壓、降膽固醇和抗潰蕩等功能,同時可以改善腸道微生態環境等[5-9]。另外,植物乳桿菌EPS還可以用作納米材料的穩定劑。例如,用植物乳桿菌EPS制備得到的多糖/硒納米顆粒(exopolysaccharides selenium nanoparticles,E-SeNPs)在水中的穩定性和分散性高,具有良好的抗氧化活性[10],可以作為安全和高效的藥物使用。同時,胞外多糖還可以作為高效的染料廢水色素吸附劑使用,提高環境效益。與此同時,植物乳桿菌在發酵過程中還可以生產副產物DL-乳酸,可以用做酸味劑、強化劑、防腐劑等,廣泛地應用于食品、醫藥、化工等行業。在國內,目前DL-乳酸市場價格約15 000元/t,市場前景十分可觀。

目前,植物乳桿菌多糖主要通過真菌發酵或從植物中提取得到。但是,利用細菌進行EPS工業化生產的相關報道較少,主要包括：來自腸膜明串珠菌的右旋糖酐,用野油菜黃單胞菌發酵得到的黃原膠[11],來源于伊樂假單胞桿菌發酵的結冷膠[12],以及通過谷氨酸棒桿菌發酵得到的透明質酸[13]等。限制EPS工業發酵生產的因素主要是發酵原料(昂貴的培養基)和操作成本(好氧發酵體系黏度高、攪拌耗電量大)高；多糖精制提取難度大、成本高；某些生產菌種是非食品級細菌,不能用于食用、藥物和人類健康等領域。相比于上述微生物多糖,植物乳桿菌多糖在食用安全和厭氧發酵及不需大量耗電等方面更具優勢。植物乳桿菌發酵體系的黏度相對較低,EPS提取工藝較簡單、精制成本較低。但是,目前產植物乳桿菌多糖的菌株依舊存在著多糖產量低和原料成本高等問題,制約了植物乳桿菌多糖的實際應用。據報道,在對培養基成分進行優化以后,EPS產量也只能達到50～600 mg/L的水平[4,14]。MACEDO等[15]通過優化培養基成分使EPS產量達到2.78 g/L,是現有報告中乳桿菌EPS的最高產量。用LactobacilluskefranofaciensWT-2B生產乳酸菌EPS,產量也可以達到2.50 g/L的水平[16]。還有研究者使用廉價的RH培養基(含大米淀粉和蛋白、可用做發酵的碳氮源)進行多糖發酵,節約了原料成本[17]。

本研究室前期研究中,從富源泡菜中分離出1株高產EPS的菌株LactobacillusplantarumR040。搖瓶實驗發現,使用MRS培養基、LactobacillusplantarumR040在31 ℃、pH 6、接種量3%(體積分數)條件下發酵18 h,EPS-R040產量最大,達到1.80 g/L。EPS溶解在水中并與功能性硒納米顆粒混合后可以得到穩定性和均一性較好的硒納米產品,EPS還具有良好的吸附染印廢水色素的能力[18]。理論上、L.plantarum可以在控制pH的條件下,量產EPS-R040,但也可能造成副產物乳酸的大量積累,而乳酸又可能會對植物乳桿菌細胞的生長產生抑制,進而影響主產物植物乳桿菌EPS的合成。本論文以L.plantarumR040為模式菌株,在5 L攪拌發酵罐中進行擴大培養,利用不同的發酵工藝,包括常規發酵、生物催化、生物催化/液液萃取復合策略緩解乳酸對主產物——植物乳桿菌EPS合成的抑制,以及基于pH-Stat法自動流加葡萄糖的反復生物催化等策略進行EPS發酵,為高效經濟發酵生產植物乳桿菌EPS提供新的途徑和重要參考,并對規模發酵得到的植物乳桿菌EPS與搖瓶發酵得到多糖的特性進行分析比對。研究內容具有一定的理論意義和潛在的應用價值。與此同時,通過自由選擇發酵操作工藝,在提高植物乳桿菌EPS產量的同時,聯產副產物乳酸,有望降低生產成本和實現發酵產品多樣性。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

本實驗采用的L.plantarumR040分離于中國云南的富源泡菜,保藏于本實驗室,菌株保藏于甘油管中(-20 ℃)。

1.2 主要儀器與設備

Bailun-Bio 5 L發酵罐,上海百侖生物設備工程有限公司(配有pH/DO電極和控制柜);SBA-40C生物傳感分析儀,山東省科學院生物研究所；1100高效液相色譜儀,美國Agilent公司；510工業控制計算機,臺灣研華科技有限公司；VORTEX 21K和H1850R離心機,湖南湘儀設備有限公司。

1.3 傳統發酵培養基

MRS培養基(g/L)：蛋白胨10.0,牛肉浸粉8.0,酵母浸粉4.0,葡萄糖20.0,K2HPO42.0,檸檬酸氫二銨2.0,乙酸鈉5.0,MgSO40.2,MnSO40.04,吐溫80 1.0。pH 5.7,以水溶解,121 ℃滅菌15 min。

1.4 磷酸緩沖液

pH 6的磷酸緩沖液：預先配制1 mol/L的NaH2PO4和Na2HPO4溶液,然后將877 mL 1 mol/L的NaH2PO4溶液和123 mL 1 mol/L的Na2HPO4溶液混合,121 ℃滅菌 15 min。

1.5 培養/發酵方法

L.plantarumR040活化培養：取100 μL甘油管保藏的菌種接種到10 mL MRS培養基中,在31 ℃靜置培養18 h后,得到種子液。

250 mL搖瓶下的細胞培養：按照5%的接種量將L.plantarumR040種子液接種到MRS肉湯培養基中,裝液量為100 mL,在31 ℃培養箱中靜置培養18 h。

5 L發酵罐下的常規發酵：在多個上述搖瓶中進行細胞培養,按需要接種,經離心(8 000 r/min,30 min,4 ℃)分離得到半固態菌體,然后用少量新鮮培養基將細胞溶解。“濃縮”細胞液作為種子液接種至5 L發酵罐(MRS培養基裝液量2 L)中,接種量為5%。發酵溫度控制在31 ℃。用50%的氨水將pH控制在5.9。根據不同需求,使用通氣或不通氣發酵。控制攪拌轉速在20～100 r/min。葡萄糖耗盡,pH突然上升后流加500 g/L的葡萄糖濃縮液。當乳酸濃度不再增加時,終止發酵。

生物催化法發酵：將5 L發酵罐的常規發酵結束時的發酵液進行離心(8 000 r/min,30 min,4 ℃),得到的細胞保存于磷酸緩沖液中,置4 ℃冰箱中待用。使用時直接將含細胞的緩沖液與適當濃度的葡萄糖溶液直接混合,在5 L發酵罐內發酵,實際裝液量1 L。

1.6 分析方法

葡萄糖、L-乳酸：用生物傳感分析儀測定。

總乳酸(DL-乳酸)：采用Agilent公司的HPLC進行測量。色譜條件：反相柱C18柱,溫度30 ℃,洗脫液流速0.8 mL/min,洗脫液：5%甲醇+0.05%磷酸+94.95%水。

EPS：將發酵液離心(9 500 r/min、4 ℃、20 min)取上清液,在發酵上清液中加入800 g/L的三氯乙酸,最終三氯乙酸質量濃度為40 g/L,置4 ℃冰箱過夜,去除蛋白質后離心(6 080 r/min、4 ℃、15 min) 取上清液,加入3倍體積的無水乙醇置于4 ℃冰箱過夜,沉淀多糖；相同條件下再次離心,去除上清液,得到多糖沉淀物,用少量蒸餾水充分溶解多糖沉淀物。最后,將溶解后的多糖放入透析袋,置于裝有2 L蒸餾水的3 L燒杯中,在4 ℃下透析2 d,換水6次,取出透析袋中的多糖溶液凍干稱重,測量EPS產量。

細胞測量：在600 nm下測量光學密度OD600 nm值,將發酵結束后離心得到的濕菌體置于烘箱內烘干至恒重,得到單位體積細胞干重ρ=0.21OD600 nm。

1.7 EPS的應用

1.7.1 EPS制備硒納米材料的方法

將2.98 mL的Na2SeO3溶液(4 mg/mL)加入到1 mg/mL的EPS-R040 多糖溶液中,使Se與EPS的質量比為4∶3,劇烈攪拌過夜,然后將與Na2SeO3等體積的抗壞血酸(18 mg/mL)緩慢加入到上述混合液中,室溫下攪拌6 h,將所得溶液于4 ℃透析2 d,將其凍干,室溫儲存在裝有硅膠的干燥器中備用。

1.7.2 EPS吸附印染廢水中亞甲基藍(methylene blue,MB)的方法

配制0.8 g/L多糖水溶液,置于80 ℃恒溫水浴鍋中,待多糖全部溶解,室溫冷卻。剪取8 cm的透析袋(市售,截留相對分子質量10 kDa),裝入5 mL多糖溶液于透析袋中,用塑料繩結扎兩端,將其置于MB質量濃度為500 mg/L的燒杯(裝液量50 mL)中。將透析袋在燒杯中浸泡24 h,確保最終的吸附平衡,每2 h取樣1次。溫度控制在25 ℃,重復3次。

2 結果與討論

2.1 250 mL搖瓶中的多糖發酵

前期研究中,在250 mL搖瓶規模下,對利用L.plantarum的EPS發酵條件進行了優化。結果發現,在31 ℃、pH 6、接種量3%的條件下發酵18 h,EPS產量最高可達到1.80 g/L[18]。重復實驗顯示,最高EPS質量濃度為1.58 g/L,較前期發酵水平略低。為此,在5 L發酵罐中進行利用L.plantarum生產EPS的發酵,控制pH,提高EPS產量和乳酸濃度,量產EPS。

2.2 5 L發酵罐上的多糖發酵

首先,在5 L發酵罐中進行常規發酵,即分批補料發酵。結果如圖1、圖2和表1所示。使用研究室自行開發的BioJN控制系統,在工業控制計算機上顯示發酵數據曲線圖,并據此手動添加葡萄糖濃縮液。如圖1-a所示,當葡萄糖耗盡時,乳酸合成停止,pH維持在高位(6.0)不變,此時按需要流加不同量的葡萄糖濃縮液。加入葡萄糖后,乳酸合成重新開始、pH迅速下降、降至低位(5.9)時,重新自動流加氨水調節pH。乳酸發酵屬于兼性厭氧發酵,在通氣情況下,發酵初期(2 h)溶氧濃度就開始不斷上升、說明通氣發酵并不能改善L.plantarum發酵生產EPS的性能,因此在后續實驗中均使用不通氣策略進行發酵,以降低操作成本。

a-常規流加發酵、通空氣發酵中的pH和DO變化;b-L.plantarum發酵所產L-乳酸和總乳酸濃度之間的定量關系圖1 5 L發酵罐中生產EPS時的pH/DO變化情況以及L-乳酸和總乳酸濃度之間的關系Fig.1 pH/DO variations in exopolysaccharides production and the relationship of L-lactate/total lactate concentrations in 5 L fermentor

■-L-乳酸；●-EPS；○-葡萄糖；▲-OD600 nm a-常規發酵,攪拌速度50 r/min,通氣量0.1 vvm；b-常規發酵,攪拌速度50 r/min,不通氣； c-生物催化,攪拌速度20 r/min,不通氣；d-生物催化+液液萃取復合操作策略,攪拌速度100 r/min,不通氣圖2 不同發酵策略下的EPS發酵性能Fig.2 Exopolysaccharides fermentation performance with different operating strategies

經測定,L.plantarum生產的乳酸為DL-乳酸。將批次#4的樣品(表1)分別用生物傳感儀和HPLC進行乳酸濃度測定,得到圖1-b所示的L-乳酸和總乳酸濃度的校正曲線。L-乳酸和總乳酸濃度呈線性關系,擬合公式為y=2.103x(y,總乳酸含量;x,L-乳酸含量),說明L-乳酸和D-乳酸產量基本相等。

表1 不同操作條件下EPS發酵生產的性能比較Table 1 The exopolysaccharides fermentation performance with different strategies

2.2.1 常規發酵生產EPS

在5 L罐下進行常規發酵實驗,發酵批次#1(通氣)和批次#2(不通氣)的攪拌轉速均為20 r/min,最高EPS質量濃度分別為1.72 g/L和1.93 g/L(表1),略高于搖瓶發酵的水平(1.58 g/L)。在發酵批次#3(表1,圖2-a,通氣)和#4(表1,圖2-b,不通氣)中、將攪拌轉速提升到50 r/min。上述2個批次中,當葡萄糖耗盡,pH停留在高位水平不再變化時,手動流加葡萄糖濃縮液提升葡萄糖濃度。2個批次中,細胞均在10 h左右停止生長；L-乳酸持續積累增加直至發酵結束,最終質量濃度達到29～35 g/L的水平；EPS質量濃度在12～14 h后也不再增加,其中,批次#3和批次#4的最大EPS質量濃度分別為2.25 g/L和2.29 g/L,相比搖瓶發酵的水平(1.58 g/L)分別提高了42.4%和44.9%。圖2-a和圖2-b的結果顯示,多糖和乳酸合成均屬于典型的生長半耦聯型過程。由于初始細胞濃度(OD600 nm)較低,且細胞生長在12～14 h后基本停止,導致EPS濃度偏低。為了解決上述問題,考慮使用生物催化法提高初始細胞濃度,來提升EPS濃度。

2.2.2 生物催化法生產EPS

將常規發酵批次#3結束時的發酵液進行離心分離,所得濕細胞直接投入到磷酸緩沖液中,置4 ℃冰箱保存(保存期不超過1個月)。再將含休眠細胞的磷酸緩沖液與適當濃度的葡萄糖溶液直接復配啟動多糖發酵,裝液量為1 L,攪拌轉速為20 r/min(發酵批次#5,表1)。此時,初始細胞濃度(OD600 mm)高達33.50 g/L,此后略有下降,促進了多糖合成。EPS濃度在9 h左右就達到3.34 g/L的最高水平,比搖瓶發酵的最高水平(1.58 g/L)提高了110%,0～9 h多糖得率和生產效率分別達到0.08 g/g和0.37 g/(L·h)。與常規發酵類似,當葡萄糖耗盡時,手動流加葡萄糖濃縮液、將葡萄糖濃度提升到10 g/L的水平。使用生物催化法生產多糖,雖然細胞不再生長,但由于初始細胞濃度高,發酵9 h時、L-乳酸產量就達到22 g/L的水平(總乳酸46.20 g/L),以后繼續上升直至發酵結束(L-乳酸～32 g/L,總乳酸67.20 g/L)。由于乳酸濃度高會對細胞合成EPS產生抑制,發酵9 h后多糖濃度不再繼續上升。因此,有必要限制乳酸的快速積累,進一步提升EPS濃度。總體上,與常規發酵相比,使用生物催化發酵工藝提高了EPS濃度,縮短了發酵時間,簡化了配料過程,降低了原料成本(只使用葡萄糖),發酵總體性能得到改善。

2.2.3 生物催化+液液萃取復合工藝生產EPS

乳酸對乳酸菌生長有抑制作用[19]。為此,在250 mL搖瓶中添加不同濃度的L-乳酸,控制葡萄糖初質量濃度在20 g/L、裝液量100 mL。啟動植物乳桿菌合成EPS的發酵。發酵18 h結束,結果如表2所示。隨著初始乳酸濃度的增加,L.plantarum菌體生長受到抑制,EPS產量也不斷降低。當初始乳酸質量濃度達到10 g/L時,細胞基本不生長,EPS濃度很低,說明乳酸確實對細胞生長和EPS合成具有抑制作用。

表2 乳酸濃度對發酵性能的影響Table 2 Effects of lactic acid concentrations on fermentation performance

還有文獻指出,使用油醇為萃取劑(含體積分數15%的 Alamine 336)形成油水兩相的液液萃取發酵體系,可以將發酵液中的乳酸原位移除到油相中,降低發酵液相中的乳酸濃度,促進乳酸菌生長、提高菌體濃度[20]。但是,Alamine 336對乳酸菌細胞具有一定毒性[21]。使用與生物催化同樣的方法配制細胞懸濁液。首先利用生物催化法啟動發酵,攪拌速率20 r/min,裝液量1 L。發酵3 h、按體積比1∶3添入含15%(體積分數) Alamine 336的油醇(油水兩相總體積1.33 L),開始進行生物催化+液液萃取復合工藝的EPS發酵。增加攪拌速度至100 r/min,使萃取劑與發酵液充分混合,整個發酵體系呈乳化狀態,有效原位移除發酵液中的乳酸。如圖2-d所示,細胞濃度穩定在40(OD600 nm)的高水平,EPS質量濃度在9 h迅速升高到4.75 g/L,比搖瓶發酵水平(1.58 g/L)提高了200%,0～9 h,多糖得率和生產效率分別達到0.09 g/g和0.53 g/(L·h)。發酵性能有了進一步提高。但是,9 h后乳酸仍在積累,為此在發酵后期,當pH停留在高位的現象出現時,每次只添加2 g/L-broth的葡萄糖。其目的在于,利用葡萄糖受限的條件進一步抑制乳酸積累,但是9 h、EPS濃度達到最高值后迅速下降,結果不盡人意。

萃取劑油醇價格高,必須要對其進行回用,上述工藝才具有實際意義。為此,用水對發酵結束時油醇中的乳酸進行反向萃取,降低油醇中的乳酸濃度、實現油醇回用。在燒杯中,將油水體積比分別控制在1∶3、1∶5、1∶8、1∶10、1∶20和1∶50進行反萃,用磁力攪拌器攪拌6 h,盡可能將乳酸提取到水相中。然后對水相中的L-乳酸和EPS濃度進行測定,當水相中L-乳酸濃度恒定后停止反萃。用公式(1)物料平衡方程對油醇的乳酸萃取系數進行計算:

A=CWVW+COVO

(1)

式中：A,乳酸總量;CW,水相中的乳酸濃度;CO,油相中的乳酸濃度;VW和VO分別代表水相和油相的體積。將公式(1)變形得到公式(2)：

(2)

a-反向萃取;b-EPS推定圖3 反向萃取油醇中的乳酸和EPS推定油醇 與它們的萃取系數關系Fig.3 Counter extracting lactic acid and EPS in oleyl alcohol to estimate their extraction coefficients

用同樣方法計算油醇對EPS的萃取系數m*(m*=0.2)。結果發現,油醇對EPS的萃取系數很低(圖3-b,W*為多糖的水相濃度),EPS幾乎全部存在于發酵液相。總體上,使用生物催化+液液萃取復合工藝可以進一步提高EPS濃度。但是,由于油醇對乳酸的萃取系數不高、油醇回用困難,如果每批次發酵都用新鮮油醇,則操作成本太高,限制了該工藝的實用性。

2.2.4 使用基于pH-Stat葡萄糖流加法的反復生物催化工藝生產EPS

使用生物催化和生物催化+液液萃取復合工藝生產EPS的發酵體系,發酵液相中的乳酸積累依舊無法控制。因此,考慮使用pH-Stat葡萄糖流加工藝來生產EPS。pH-Stat法根據pH的變化,可將發酵液中的葡萄糖濃度自動控制在低水平,限制乳酸積累。另外,單純的生物催化和生物催化+液液萃取復合工藝每次都需要利用常規發酵(使用MRS培養基)工藝來獲取休眠細胞,原料成本高、操作復雜,經濟性能較差。因此,提出了使用基于pH-Stat葡萄糖流加法的反復生物催化策略強化EPS生產的發酵工藝。

先使用常規發酵法收集反復生物催化所需的菌體(反復生物催化批次#1,總發酵批次#7,表1),初始葡萄糖質量濃度為6 g/L,葡萄糖耗盡后,pH-Stat流加葡萄糖自動啟動。結果如圖4-a所示。此時,乳酸濃度在發酵18 h時仍處在10 g/L以下,乳酸積累確實得到了抑制。但是,細胞生長也受到抑制,18 h時OD600 nm只能達到11.4的低水平,無法滿足收集足夠菌體為次輪發酵服務的目標。故在18 h后,當出現葡萄糖匱乏的現象時,手動流加葡萄糖濃縮液,將葡萄糖質量濃度一次性提升至20 g/L的水平(18 h后的數據未在圖4-a中顯示)。發酵27 h,OD600 nm達到了26.2的較高水平,離心分離收集菌體,為次級反復生物催化生產EPS所用。第2次反復生物催化發酵生產EPS,OD600 nm穩定在40的水平不變,EPS質量濃度在9 h達到最大值3.33 g/L,與發酵批次#5的水平相等(表1,圖4-b,發酵批次#8),多糖得率也大幅提高,達到0.16 g/g。L-乳酸質量濃度最大為23 g/L。發酵結束后,再次收集菌體為第3次反復生物催化發酵生產EPS所用,依此類推。但是,在細胞收集和磷酸緩沖液處理休眠細胞的過程中,細胞總量有所損失,第3次反復生物催化時的初始細胞濃度OD600 nm下降到25,EPS質量濃度在12 h達到最大值2.62 g/L。然而,EPS/X(EPS與細胞量之比)卻從0.370 g/g增加到0.540 g/g(表1),說明細胞活性并沒有下降,絕對EPS濃度下降的原因是因為初始細胞總量減少了。15 h發酵結束時乳酸質量濃度為17.25 g/L,乳酸積累基本得到控制。第5次反復生物催化生產EPS時,初始細胞量和EPS最大濃度(OD600 nm=17.0,EPS質量濃度在12 h時為1.88 g/L,表1和圖4-e)繼續下降。但EPS/X仍可維持在0.506 g/g的水平(表1),最終L-乳酸質量濃度僅有13.75 g/L。

■-L-乳酸；●-EPS；○-葡萄糖；▲-OD600 nm a-常規發酵(回用批次#1)；b～e -多次反復生物催化(#2～#5)圖4 使用基于pH-Stat葡萄糖流加法的反復生物催化時的發酵性能Fig.4 EPS fermentation performance with pH-Stat strategy based repeated bio-catalysis

生物催化法發酵生產EPS需要較高濃度的初始細胞,每次都通過常規發酵獲取所需細胞,增加了原料成本(使用昂貴的MRS培養基)。使用基于pH-Stat葡萄糖流加法的反復生物催化工藝生產EPS,提高了發酵自動化程度,5次連續回用EPS/X基本不變,細胞活性沒有下降。如果將第一次常規發酵的裝液量增大(反復回用批次#1,常規發酵),可提高細胞總量,則各反復生物催化批次的絕對EPS濃度仍可以保持在較高水平。但是由于本論文將常規發酵的裝液量統一在2.2 L的水平上,故沒有在更高初始裝液量的條件下進行常規發酵操作。總之,使用基于pH-Stat葡萄糖流加法的反復生物催化工藝生產EPS,可以縮短發酵時間、緩解乳酸積累、簡化配料和發酵操作過程,具有一定的實用性。

2.2.5 植物乳桿菌生產EPS的同時聯產副產物DL-乳酸

利用L.plantarum發酵生產EPS的同時,還可聯產副產物DL-乳酸。使用基于pH-Stat法流加葡萄糖濃縮液的發酵批次中,DL-乳酸積累雖然得到了一定程度的控制,DL-乳酸濃度(總乳酸濃度,表1)仍可維持在28～50 g/L的水平,但是,基于pH-Stat流加葡萄糖法的反復生物催化工藝得到的EPS性能指標較高,整體發酵性能的評價最終還取決于多糖濃度、多糖得率、乳酸濃度和發酵原料/操作成本之間的綜合權衡(Trade-off)。

2.3 碳源控制和菌體累積提高EPS產率

EPS的合成是一個耗能的過程,合成前體糖核苷酸、磷酸化脂載體、聚合重復單元及轉移輸出集合體都需要能量,這些能量由糖酵解產生的ATP提供[22]。提高葡萄糖消耗,過量生產ATP可以有效地提高多糖的產量。菌體生長也需要耗費大量ATP,而使用生物催化法進行發酵時,初始菌體濃度高,雖然發酵過程細胞生長基本停止,但這可以節約大量的ATP,將其有效地利用于EPS合成途徑。由圖5可知,乳酸和EPS合成也在互相爭奪和競爭葡萄糖的利用。使用基于pH-Stat葡萄糖流加法的反復生物催化策略進行EPS發酵,可以抑制乳酸積累,進而改善L.plantarum發酵生產的EPS產量和EPS對葡萄糖的得率。

2.4 規模發酵(罐發酵)所獲EPS的結構、特性及其應用情況

本研究室前期的實驗結果表明,EPS-R040是由半乳糖、葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸組成,其摩爾比為1.4∶9.4∶3.4∶1.0,包含68.9%的C、28.5%的O、2.3%的N、0.1%的S和0.3%的P。EPS表面上還帶有孔(0.38 μm)或洞穴,表現出粗糙的多孔網絡狀結構,可極大增加與染料的接觸面積,對印染廢水中的主要色素物質MB有良好的吸附能力,最大吸附容

圖5 L.plantarum發酵生產EPS時的乳酸/EPS代謝途徑Fig.5 Metabolic pathway of EPS and lactic acid in EPS fermentation by L.plantarum

量為163.1 mg/g。它還具有出色的脫附能力,循環使用3次并不會明顯喪失吸附能力。在相同條件下(相同用量、相同溫度、相同時間),EPS對MB的吸附能力分別是葡聚糖、黃原膠和結冷膠的12.5、2.2、3.2倍[23]。EPS還可以合成具有良好分散性和穩定性的E-SeNPs,其平均粒徑為(45.17±11.9)nm、帶負電荷(-31.3 mV)。同時,由于包覆作用,該E-SeNPs在水溶液中可穩定存在20 d。相同濃度下,E-SeNPs的還原力、ABTS陽離子自由基清除率都明顯高于EPS和硒納米顆粒(selenium nanoparticles,SeNPs),表現出良好的抗氧化活性[10]。

在相同用量條件下,本研究對使用基于pH-Stat葡萄糖流加法的反復生物催化策略進行EPS發酵時,所產EPS對MB的吸附能力與其他市售多糖(葡聚糖、黃原膠和結冷膠)的吸附能力進行了比較。使用不同多糖復配溶液吸附MB 24 h后,透析袋中的MB積聚圖像如圖6-a所示。植物乳桿菌L.plantarum所產EPS對MB的吸附量為135.1 mg/g,分別是葡聚糖、黃原膠和結冷膠吸附能力的6.9、1.6和2.0倍(圖6-b)。與搖瓶條件下所產EPS對MB的吸附能力基本相同。用L.plantarum反復生物催化法所得EPS與SeNPs復配得到E-SeNPs,用透射電鏡對其形態結構進行了觀察分析。當不添加EPS時,形成的SeNPs(圖6-c)不能分散成團簇。而用EPS復配得到的E-SeNPs具有均勻分散的球形結構(圖6-d),平均粒徑分布頻率為(46.6±11.5)nm,表明EPS對SeNPs具有良好的分散和穩定作用,與搖瓶發酵所得EPS的結果基本一致。

a-吸附24 h后,透析袋中MB的吸附圖像；b-EPS-R040、葡聚糖、黃原膠、結冷膠對MB吸附量； c-SeNPs的透射電鏡圖；d-E-SeNPs的透射電鏡圖及粒徑統計圖6 L.plantarum所產EPS對MB吸附能力及其復配硒納米材料E-SeNPs的透射電鏡結果Fig.6 Adsorption of MB by EPS and TEM results of E-SeNPs注：采用SPSS軟件進行單因素方差分析,對葡聚糖、黃原膠、結冷膠的MB吸附量和EPS-R040的MB吸附量進行比較,P值分別為6.46×10-7, 4.64×10-5,5.75×10-5;*：P<0.01,代表葡聚糖、黃原膠、結冷膠對MB的吸附量和EPS-R040對MB的吸附量均存在極顯著性差異

3 結論

對在5 L發酵罐條件下,利用植物乳桿菌L.plantarum高效生產功能性EPS,并對其應用進行了研究。使用基于pH-Stat自動流加葡萄糖法的反復生物催化策略進行EPS發酵的整體性能最佳。該策略可以提升EPS產量,省去昂貴的MRS培養基的使用,降低發酵的原料和操作成本,實現EPS的量產和發酵過程的自動化控制,改善了發酵過程的經濟性。與搖瓶相比,發酵罐上量產所得EPS復配處理硒納米材料、所得EPS-硒納米溶液的均一性/穩定性、EPS對印染廢水中有害物質色素的吸附能力基本不變。該策略還可聯產40 g/L的DL-乳酸,從而實現發酵產品的多樣性。