玉米黃烷酮-3-羥化酶原核表達條件對香橙素生成量的影響

黃旭,王振,劉娟,肖妃垚,田苗苗,郭佳婧,單楊

1(湖南大學 隆平分院,湖南 長沙,410082)2(湖南省農業科學院 農產品加工研究所/果蔬貯藏加工與 質量安全湖南省重點實驗室/湖南省果蔬加工與質量安全國際科技創新合作基地,湖南 長沙,410125)

柑橘種植面積及產量巨大,但柑橘皮渣的綜合利用是一大問題。柑橘作為食品原料直接食用或加工時會產生近半數未利用的廢物,目前柑橘皮再利用的一大方向是副產物提取,包括香橙素、柚皮素及其糖苷、橙皮素等。其中柚皮素及其苷類物質含量較香橙素高,如何綠色高效的獲得香橙素已成為柑橘加工業亟待解決的一大難題。

香橙素,又名二氫山奈酚,是一種重要的二氫黃酮醇化合物。香橙素具有強抗氧化性,可以高效清除自由基,它還具有改善重癥急性胰腺炎[1]、抗關節炎[2]、抗肝損傷[3]的作用。此外,香橙素也是多種具有重要價值的類黃酮化合物的前體物質,如二氫槲皮素、花青素和山奈酚等。

目前二氫黃酮醇的生產主要通過從植物中直接提取[4]來完成,少部分也可通過化學方法進行合成[5]。其中直接提取法存在一定的局限性[6],包括受季節和產地影響較大,提取效率較低、耗時長、各異構體的分離難等問題；而化學合成法又因環境污染嚴重且毒性較大的問題[7]無法廣泛應用。與其他方法相比,生物轉化法具有較高的特異性和環境相容性,具有更大的發展潛能。采用微生物法生產香橙素等二氫黃酮醇類化合物,不受季節影響,反應溫和,選擇性強并且微生物還具有生長迅速和對環境污染小等優勢[8-9]。

黃烷酮-3-羥化酶(flavanone-3-hydroxylase,F3H)在類黃酮化合物的生物代謝途徑中十分必要,它能引導碳流流向碳3號位羥基黃酮類化合物的生產,是下游黃酮醇和花青素合成過程中的關鍵步驟[10]。F3H是一種雙加氧酶,它依賴于Fe2+和α-酮戊二酸[11],具有十分保守的同源性和遺傳穩定性。它催化黃烷酮如柚皮素和圣草酚等形成包括香橙素在內的二氫黃酮醇。F3H第一次從矮牽牛[12]中成功分離后,陸續也從許多其他物種中克隆出來,如龍眼[13]、醋栗[14]等。其中一些基因在酵母、大腸桿菌或植物中已有功能性表達[15-19]。大腸桿菌是一種遺傳背景清晰的微生物,已被用作多種蛋白質表達和小分子異源生物合成的重組宿主[20],成為重要的工業模式菌株。目前香橙素在國內外多作為中間產物來連接上下游黃酮化合物,對其表達含量的研究較少。

本研究在前期構建原核表達載體pET32a-ZmF3H的基礎上,對重組蛋白誘導表達,催化以柚皮素為底物生成香橙素的反應,并對蛋白表達條件進行單因素試驗優化,從而初步提高香橙素產量,為今后合成香橙素反應條件優化及研究F3H蛋白純化條件提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料與試劑

從GenBank數據庫中獲取來自玉米的Zmf3h(U04434.1)核酸序列并由上海生工公司合成,pET32a購自上海生工公司,大腸桿菌BL21(DE3)、JM109均為本實驗室保存。

液體Luria-Bertani(LB)培養基、固體LB培養基、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒,北京索萊寶科技有限公司；質粒小量抽提試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG),上海瑞永生物科技公司；蛋白marker(10～170 kDa),美國Thermo公司；柚皮素標準品、香橙素標準品,質量分數≥98%,上海源葉生物科技有限公司。其余試劑均為國產分析純。

1.1.2 儀器與設備

ZQPZ-115型組合式振蕩培養箱,天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；MDF-86V408型醫用低溫保存箱,安徽中科都菱商用電器股份有限公司；SYNERGY H1型酶標儀,美國Bio Tek公司；H-class超高效液相色譜儀,美國沃特世公司；qtof6550型質譜儀,美國安捷倫公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell1658004型蛋白電泳儀,美國Bio-Rad公司；5424R小型臺式高速離心機,德國艾本德股份公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 目的菌株的構建與培養

在BamHI和HindIII位點進行酶切將Zmf3h與pET32a相連,轉入JM109感受態細胞,挑選陽性克隆送至生工公司(上海)進行測序,提取其質粒轉入制備好的感受態大腸桿菌BL21(DE3)。加入100 μL 液體LB培養基,在37 ℃、200 r/min搖床中培養30 min。取70 μL已活化的菌液,將已加入氨芐青霉素的LB固體培養基預熱,用無菌涂布棒將菌液涂布均勻。待平板吸收菌液倒置于37 ℃培養箱過夜培養。

取單菌落在加入抗性的液體LB培養基中培養,在37 ℃,220 r/min搖床中培養至OD600=0.7時加入IPTG使其終濃度為0.2 mmol/L,進行誘導表達。24 h后在誘導后的菌液中添加終濃度為0.1 mmol/L的FeSO4、100 mg/L的柚皮素以及終濃度為8.2 mmol/L的α-酮戊二酸,繼續在搖床中培養24 h。

1.2.2 重組表達載體產物鑒定

取5 mL發酵液轉移至離心管中,用超聲將發酵液破碎后加入同體積乙酸乙酯進行萃取,靜置30 min后在3 700 r/min、4 ℃、條件下離心(10 min),取上層乙酸乙酯進行氮吹,待其完全揮發后加入1 mL甲醇復溶,將得到的溶解液經0.22 μm濾膜過濾后轉移至液相瓶,用HPLC進行分析并在電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI)負離子模式(U=175 V)下進行質譜分析。

1.2.3 ZmF3H蛋白位置的確定

為確定ZmF3H在大腸桿菌中表達的位置,將目的菌株加入IPTG后誘導表達4 h,取適量全細胞發酵液和離心后的發酵上清液,將剩余發酵液經400 W、7 min超聲破碎后重懸,取勻漿液、離心后的上清液以及沉淀,將各組按照4∶1(體積比)加入5×蛋白上樣緩沖劑,混勻后在100 ℃的沸水水浴加熱5 min后馬上放入冰中預冷。制備電泳膠后用SDS-PAGE檢測。

1.2.4 ZmF3H蛋白表達條件的優化

為進一步提高香橙素產量,設計單因素試驗來探討ZmF3H蛋白表達過程中的最佳反應條件,并采取高效液相對產物進行定量分析。

1.2.4.1 菌體密度對香橙素生成量的影響

取30 μL菌液到3 mL液體LB培養基(含有100 mg/L的氨芐青霉素)中,在37 ℃、220 r/min條件下過夜活化。按照1%接種量接種到30 mL液體LB培養基中擴大培養,當OD600分別為0.4、0.6、0.8、1和1.2時,添加IPTG使其終濃度為0.2 mmol/L進行誘導表達。在23 ℃、220 r/min的搖床中培養24 h。加入底物柚皮素及輔因子后繼續發酵24 h,取發酵菌體經超聲破碎、萃取、離心,收集上清液后用HPLC檢測香橙素的含量。

1.2.4.2 IPTG終濃度對香橙素生成量的影響

培養條件同1.2.4.1。培養至OD600=0.6時,添加終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mmol/L的IPTG,在23 ℃、220 r/min的搖床中繼續培養24 h,取樣破碎離心后取上清液進行SDS-PAGE檢測。加入底物及輔因子后用HPLC檢測香橙素含量。

在96孔板中加入200 μL的菌液,以OD600=0.2為起點添加不同終濃度的誘導劑IPTG,在37 ℃條件下振板培養,每0.5 h用酶標儀測定OD600。

1.2.4.3 誘導時間對香橙素生成量的影響

培養條件同1.2.4.1。培養至OD600=0.6時,添加終濃度為0.2 mmol/L IPTG,在23 ℃、220 r/min的搖床中分別培養4、8、12、20和24 h,加入底物及輔因子后用HPLC檢測香橙素含量。

1.2.4.4 誘導溫度對香橙素生成量的影響

培養條件同1.2.4.1。培養至OD600=0.6時,添加終濃度為0.2 mmol/L IPTG,分別在溫度為13、18、23、28、33和38 ℃,220 r/min的搖床中培養24 h,取樣破碎離心后取上清液進行SDS-PAGE檢測。加入底物及輔因子后用HPLC檢測香橙素含量。

2 結果與分析

2.1 ZmF3H蛋白位置的確定及重組表達載體產物鑒定

目的蛋白分子質量約為41 kDa,重組載體中融合的硫氧還蛋白等標簽分子質量大約22 kDa,因此外源蛋白在大腸桿菌中總蛋白的分子質量約為63 kDa,由圖1可知,與空載相比,有新的蛋白條帶出現,且新條帶與預測的目標蛋白在大腸桿菌體內總蛋白的分子質量基本一致,說明ZmF3H在大腸桿菌中已經成功表達。發現在3、5和6泳道有明顯的亮帶,4和7泳道無明顯條帶,說明ZmF3H在大腸桿菌中已經成功表達且判斷ZmF3H蛋白存在于細胞內,屬于胞內蛋白；ZmF3H主要存在于破胞上清液中也說明ZmF3H屬于可溶蛋白。在7泳道有極輕微細條帶出現,可能是由于離心后有微量上清液殘留在下層沉淀中無法徹底分開,但可認為對此結果無影響。

M-蛋白分子質量標準；1-空載體pET32a發酵液；2-全細胞發酵液； 3-發酵液上清液；4-破碎重懸的勻漿液；5-破胞液上清液；6-破胞液沉淀圖1 SDS-PAGE分析pET32a-ZmF3H重組菌的蛋白表達Fig.1 SDS-PAGE analysis of pET32a-ZmF3H recombinant protein expression

將重組菌株誘導后進行發酵培養,圖2是重組菌株產酶催化生成香橙素的HPLC,樣品在圖譜中出現了與柚皮素、香橙素標準品出峰位置一致的峰且分離效果較好。MS結果顯示在負離子模式下樣品化合物與香橙素標準品中離子峰位置一致,證明大腸桿菌能夠成功將柚皮素轉化為香橙素。先前研究中已經成功測得經ZmF3H催化后的產物香橙素約為20.12 mg/L[21]。

圖2 表達ZmF3H重組菌株催化生成香橙素的HPLCFig.2 HPLC of aromadendrin catalyzed by recombinant strain expressing ZmF3H

2.2 單因素分析誘導表達條件

2.2.1 初始菌體密度(OD600)對香橙素生成量的影響

在不同菌體密度下添加誘導劑后生成的香橙素產量變化如圖3,隨著誘導前菌體密度的增加,香橙素產量呈現先增加后降低的趨勢。在OD600=0.8和1.0時,香橙素產量達到(20.33±0.51)和(20.23±0.42)mg/L,無顯著差異,因此判斷當OD600在0.8～1.0時產量達到最大值。誘導的時機對于香橙素產量有重要作用,推測當OD600<0.8時,細菌濃度過低造成目的蛋白ZmF3H產量也過低且容易感染雜菌,在此時加入誘導劑后影響后續催化反應的進行；菌群繼續生長到OD600>1.0時,細菌濃度過高,大腸桿菌表達外源蛋白ZmF3H的時間減少,影響工程菌的穩定性和活性,進而影響目的產物的產量。

圖3 初始OD600對香橙素生成量的影響Fig.3 Effects of induction OD600 on the production of aromadendrin

2.2.2 IPTG終濃度對香橙素生成量的影響

IPTG是常見的乳糖操縱子的誘導劑,使T7啟動子與T7 RNA聚合酶特異性結合,大量表達下游的目的基因。IPTG在合理的濃度范圍內可有效地提高表達量。在IPTG誘導體系中,誘導劑濃度會影響蛋白的表達,因此需要選擇合適的濃度。在菌種密度OD600為0.6左右,誘導溫度為23 ℃,加入不同終濃度的IPTG誘導24 h后加入底物反應測定的香橙素產量見圖4-a。隨誘導劑終濃度的增加,香橙素生成量整體呈現先增加后下降的趨勢。加入誘導劑濃度為0.6 mmol/L時,香橙素的產量最高為(26.59±1.37)mg/L。之后隨誘導劑濃度增加產量下降但仍比少量添加誘導劑時的產量高。圖4-b是不同IPTG終濃度對ZmF3H表達量的影響,當添加IPTG終濃度為0.6 mmol/L時ZmF3H表達量最高。

a-不同IPTG濃度對香橙素生成量的影響； b-pET32a-ZmF3H的蛋白電泳圖 M-蛋白Marker；1-IPTG濃度為0.2 mmol/L；2-IPTG濃度為 0.4 mmol/L；3-IPTG濃度為0.6 mmol/L；4-IPTG濃度為0.8 mmol/L； 5-IPTG濃度為1 mmol/L圖4 不同IPTG濃度對香橙素生成量的影響和 蛋白表達量的影響Fig.4 Effect of different IPTG concentrations on the production of aromadendrin and protein expression

圖5是加入不同終濃度的IPTG后大腸桿菌生長曲線圖。加入的IPTG濃度較低時對大腸桿菌的生長沒有顯著抑制作用,隨著加入的誘導劑終濃度增大菌群生長速度減緩,且無法到達大腸桿菌正常生長密度最大值。推測大腸桿菌生長減緩是由于部分物質與能量用于蛋白合成,影響了生長速度；而當IPTG濃度過高,大腸桿菌生長受到抑制可能是過高的蛋白合成速率對菌造成了負面影響。因此,當IPTG終濃度較低時,目的蛋白ZmF3H表達較少,后續與底物結合有限因此轉化量較少；當IPTG終濃度較高時,由于IPTG對細菌具有一定毒性作用,可能會抑制大腸桿菌的生長,增加原核表達系統的負載,甚至對細胞具有一定的抑制作用,從而使香橙素產量下降。

圖5 不同IPTG濃度對大腸桿菌生長的影響Fig.5 Effect of different IPTG concentrations on the growth of E.coli

2.2.3 誘導時間對香橙素生成量的影響

不同蛋白對應的最適誘導時間不同,因此誘導時間的選擇也是進行優化的重要條件。在OD600為0.6,添加終濃度為0.2 mmol/L IPTG及誘導溫度為23 ℃的條件下,香橙素在不同誘導時間下的生成量變化如圖6所示,隨著誘導時間的增加,香橙素的產量上升,在誘導時間為8 h達到最高值為(24.45±1.91)mg/L；在8 h后香橙素產量已無明顯增加并在20 h后逐步下降,推測在0～8 h目的蛋白ZmF3H開始逐步積累,之后繼續增大誘導時間未見產量增加；當持續誘導時間過長時香橙素含量下降,可能是因為菌體老化且誘導形成的蛋白有降解的可能性,蛋白的分泌程度已經小于降解程度,從而不利于柚皮素轉化為香橙素。

圖6 不同誘導時間對香橙素生成量的影響Fig.6 Effect of different induction time on the production of aromadendrin

2.2.4 誘導溫度對香橙素生成量的影響

在OD600為0.6,IPTG終濃度為0.2 mmol/L,誘導溫度分別為13、18、23、28、33 ℃的條件下,誘導24 h離心菌體進行收集并超聲破碎,發酵液用液相檢測。隨著誘導溫度的升高,產物生成量先增加后減小(圖7-a)；在誘導溫度為23 ℃,產物生成量最高為(20.50±1.51)mg/L；圖7-b是不同誘導溫度的蛋白電泳圖,在23 ℃時目的蛋白ZmF3H的可溶性表達最高。隨著溫度繼續升高,產量急速下降,可能是因為在高溫環境下進行誘導時,大腸桿菌的生長速度加快從而蛋白表達的速度也加快,就使得表達的目的蛋白無法進行正確的折疊,可溶性蛋白減少,從而減少與底物柚皮素的結合效率,影響香橙素的形成。

a-不同誘導溫度對香橙素生成量的影響；b-pET32a-ZmF3H 的蛋白電泳圖 M-蛋白Marker；1-誘導溫度為13 ℃；2-誘導溫度為18 ℃； 3-誘導溫度為23 ℃；4-誘導溫度為28 ℃；5-誘導溫度為33 ℃圖7 不同誘導溫度對香橙素生成量和蛋白表達量的影響Fig.7 Effect of different induction temperatures on the production of aromadendrin and protein expression

綜合以上單因素試驗可知,當菌體密度OD600=0.8～1時,在誘導溫度為23 ℃條件下加入終濃度0.6 mmol/L的IPTG誘導8 h,此時香橙素產量最高。經試驗驗證后發現,在此條件下香橙素產量為(32.27±1.98)mg/L,與未優化前相比增加了60.39%,香橙素生成量有顯著提高。

3 結論

以高效綠色的方式獲得柑橘中的類黃酮物質已經成為一大熱點。隨著生物合成手段的發展,引入外源代謝途徑或創造全新代謝途徑來實現和提高類黃酮物質的產量已經引起普遍關注。香橙素是聯結類黃酮各生物代謝通路的重要的代謝中間物。微生物法合成黃酮類物質本質是酶催化反應,但在表達外源蛋白階段時,常由于蛋白合成速度較快,導致無法形成正確的目的蛋白進而影響后續的酶催化反應。因此對于ZmF3H誘導階段的條件優化具有重要意義。原核表達產物的生成量與多種因素有關,其中蛋白表達階段的菌種密度、誘導劑終濃度等對于產物的生成量有影響作用。本研究選取來自玉米的ZmF3H,將其在大腸桿菌原核系統中進行表達,以柚皮素為底物成功催化得到產物香橙素,確定了外源表達ZmF3H的可行性并對菌液處理后進行蛋白電泳驗證其屬于胞內可溶性蛋白。經HPLC檢測在未經優化時原始生成量約為20.12 mg/L。在研究中探索了ZmF3H蛋白表達時期不同條件對香橙素生成情況的影響因素,結果發現,菌種密度、誘導溫度、誘導劑濃度和誘導時間均是ZmF3H蛋白表達階段提高香橙素生成量的重要影響因素。單因素試驗分析結果表明在ZmF3H蛋白表達階段當菌種密度在OD600=0.8～1.0,誘導溫度為23 ℃,誘導劑IPTG終濃度為0.6 mmol/L,誘導時間為8 h時分別能取得處理組內最佳產物生成量。綜合各單因素最優條件進行實驗驗證后發現,在最優單因素條件下其產量為(32.27±1.98)mg/L,相較于原始條件下增加了60.39%。