常壓室溫等離子誘變選育L-色氨酸高產菌株

周旭波,陳瑜琦,丁鼎,劉帥,王健

(江蘇澳創生物科技有限公司,江蘇 無錫,214000)

L-色氨酸是人和動物體內的一種必需氨基酸,是構成蛋白的重要組成部分,但人和動物自身不能合成L-色氨酸,必須從外界攝取[1]。色氨酸是生物體內合成5-羥色胺、褪黑素和犬尿氨酸等生理活性物質的前體,在生物體特定的生命活動中扮演重要角色[2-3]。在醫學上,L-色氨酸是復合氨基酸制劑和氨基酸注射液的重要原料,用于改善患者蛋白質攝入不足、氨基酸吸收障礙等問題,以及改善手術后病人的營養狀況。近年來的研究表明,色氨酸及其代謝物在許多人體疾病調控中發揮了不同的生物學效應,如部分腫瘤疾病、炎癥、肝腎疾病、糖尿病、免疫系統疾病及神經系統疾病等[4-8]。在食品和飼料添加劑領域,色氨酸可用來強化食品和做飼料添加劑,對補充食物和飼料中的營養、提高蛋白質的利用率具有重要的作用。

目前L-色氨酸的生產方法以微生物發酵法為主[9],相比傳統的化學合成法和蛋白質水解法,微生物發酵法具有更低的生產成本、更加綠色環保、更易于大規模生產等顯著的優越性[10]。微生物發酵法生產L-色氨酸的過程中,微生物菌種的優劣決定著發酵生產過程中的生產工藝、生產成本甚至產品質量,因此,選育高產色氨酸優良菌株具有重要意義。常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變技術最近幾年在科研及工業領域逐步得到應用,尤其在微生物突變育種中取得了良好的效果[11-13]。與其他誘變育種技術相比,ARTP誘變育種技術能夠更有效造成DNA的突變,并且設備操作簡單快捷,對環境條件要求較低,操作過程中安全性較高,在高效進化育種領域具有較大的應用潛力[14]。

本研究使用ARTP誘變育種技術并結合結構類似物抗性定向篩選,對色氨酸生產菌進行多次誘變處理和篩選,獲得色氨酸高產突變株,為L-色氨酸的工業化生產提供優良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

色氨酸生產菌AC-1042(Escherichiacoli),江蘇澳創生物科技有限公司保藏菌種。

1.1.2 培養基

斜面培養基(g/L):葡萄糖10,蛋白胨10,酵母浸出粉5,NaCl 5,瓊脂20,pH 7.0～7.2,115 ℃滅菌20 min。

抗性培養基:斜面培養基中加入一定量的結構類似物。

種子培養基:葡萄糖 30 g/L,(NH4)2SO42 g/L,K2HPO4·3H2O 5 g/L,KH2PO43.5 g/L,MgSO4·7H2O 1.2 g/L,酵母粉5 g/L,檸檬酸 1.2 g/L,FeSO4·7H2O 5.6 mg/L,MnSO4·H2O 2 mg/L,pH 7.0～7.2,115 ℃滅菌20 min。

發酵培養基:葡萄糖10 g/L,(NH4)2SO45 g/L,KH2PO47.5 g/L,MgSO4·7H2O 2.4 g/L,酵母粉1 g/L,檸檬酸 2 g/L,FeSO4·7H2O 75 mg/L,MnSO4·H2O 2 mg/L,ZnSO4·H2O 2.4 mg/L,pH 7.0～7.2,115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器

ARTP-II型ARTP誘變系統,無錫源清天木生物科技有限公司；YXJ-2高速離心機,常州國華電氣有限公司；30 L自動發酵罐,上海百侖生物科技有限公司；1260 Infinity II高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司；SBA-40C生物傳感分析儀,山東科學院生物研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 斜面活化培養

在無菌環境下打開保藏菌種劃線接種于活化斜面上,置于36 ℃培養箱中培養20 h。

1.2.2 菌懸液的制備

從新鮮活化斜面菌落上挑取1環接種于種子培養基中,置于搖床中培養,搖床轉數180 r/min、搖床溫度36.5 ℃,培養4.5 h后,取1 mL種子液于1.5 mL 無菌離心(Eppendorf,EP)管中,4 000 r/min離心,去除上清液,加入1 mL無菌生理鹽水,混勻,離心,反復3次,將菌懸液稀釋,使菌懸液OD600值為0.6～1.0。

1.2.3 ARTP誘變致死率的測定

取10 μL 稀釋菌液置于無菌不銹鋼載片上涂抹均勻,將載片置于ARTP誘變系統中誘變處理。ARTP 誘變條件：射頻功率120 W,處理距離2 mm,載氣流量10 標準升每分鐘(standard liters per minute,SLM),處理溫度為室溫(20～40 ℃),處理時間0、10、20、30、40、50、60、70和80 s。將處理過的載片放入裝有1 mL 無菌生理鹽水的EP管中,振蕩混勻,然后稀釋到10-1、10-2、10-3、10-4,各取100 μL均勻涂布到平板上,每個梯度做3個平行,36 ℃培養20 h后菌落計數,致死率計算如公式(1)所示：

(1)

1.2.4 ARTP誘變處理

取10 μL 稀釋菌液置于無菌不銹鋼載片上涂抹均勻,將載片置于ARTP誘變系統中誘變處理,ARTP 誘變條件同1.2.3,誘變處理時間選擇致死率達到90%以上的處理時間。將處理過的載片放入裝有1 mL 無菌生理鹽水的EP管中,振蕩混勻,然后稀釋到10-1、10-2,各取100 μL均勻涂布到平板上,每個梯度做3個平行,36 ℃培養20 h。

1.2.5 抗性篩選

制備不同濃度梯度的5-甲基色氨酸(5-methyltryptophan,5-MT)、對氟苯丙氨酸(phenylalanine,PFP)抗性培養基平板[15]。用接種環從誘變處理后培養的平板中取一滿環菌裝入無菌EP管中,使用無菌水離心洗滌2次,然后使用無菌水制成菌懸液,直接將菌懸液分別涂布于抗性平板上,36 ℃培養2～3 d。

1.2.6 菌種初篩

將種子培養基分裝到96孔板中,每孔0.1 mL,將平板上的單菌落挑到種子液孔板中,180 r/min,36 ℃ 培養6 h,并同時接種到另一塊平板上,36 ℃培養22 h后放入冰箱。將發酵培養基分裝到孔板中,每孔0.09 mL,種子液接0.015 mL,180 r/min,36.5 ℃培養20 h。挑取發酵產酸較高的菌種,將平板上對應序號的菌種挑至斜面,36.5 ℃培養20 h,甘油管保存。

1.2.7 菌種復篩

將初篩甘油管保藏的菌種分別劃一支斜面,36 ℃培養20 h。從斜面上挑1環菌至500 mL種子搖瓶中,180 r/min,36.5 ℃培養5.5 h,轉接500 mL發酵搖瓶,180 r/min,36.5 ℃培養22 h,測發酵搖瓶產酸,挑取產酸較高的菌種保藏。

1.2.8 30 L發酵罐培養驗證

將保藏的菌種劃線接種于活化斜面上,36 ℃培養20 h。從活化斜面上挑取2環接入裝液量30 mL的500 mL搖瓶種子培養基中,置于200 r/min旋轉式搖床上36.5 ℃振蕩培養至OD600值為12～14。將培養結束的搖瓶種子按體積分數10%的接種量接入發酵培養基中。初始通氣量10 L/min,初始攪拌轉速為300 r/min,通過自動流加氨水控制pH在7.0左右,培養溫度36.5 ℃。培養過程中,當溶氧降低至30%時交替提高轉速和通氣量,維持溶氧在30%～40%。當發酵液中葡萄糖質量濃度降至10 g/L時,開始流加質量分數為700 g/L的葡萄糖溶液。

1.2.9 分析檢測方法

1.2.9.1 菌體生長測定

菌液用蒸餾水稀釋后,測定600 nm下的OD600值。

1.2.9.2 葡萄糖質量濃度測定

使用生物傳感分析儀測定。

1.2.9.3 色氨酸含量測定

采用分光光度法[16]和液相色譜法[17]。

2 結果與分析

2.1 ARTP致死曲線

ARTP誘變對色氨酸生產菌的致死率與一定條件下對其處理時間有很大關系。為了獲得最佳的誘變條件,按照1.2.3的方法對出發菌進行誘變處理并計算致死率,結果見圖1。隨著ARTP誘變處理時間的延長,菌株的致死率逐漸上升,當處理時間為40 s時致死率為91.79%,處理時間為60 s時致死率為99.99%,70 s之后致死率達到100%。為對出發菌株進行有效誘變,需要有較高的致死率,本文選擇將致死率控制在90%以上的誘變處理時間,即選擇ARTP誘變時間為40 s。

圖1 不同ARTP誘變處理時間下色氨酸菌株的致死率曲線Fig.1 Lethality of L-tryptophan strains with different ARTP mutagenic treatment time

2.2 5-MT抗性菌株的篩選

5-MT是L-色氨酸的結構類似物,選育具有5-MT抗性的突變株可以減少或解除L-色氨酸對合成途徑中酶的反饋抑制和阻遏,有利于提高菌株產L-色氨酸的能力[18]。以色氨酸生產菌AC-1042為出發菌株,經ARTP誘變處理后,選育5-MT的抗性菌株。首先要確定色氨酸生產菌株對5-MT耐受的臨界濃度,將色氨酸生產菌的懸液涂布于5-MT梯度濃度平板上培養,生長情況如表1。

表1 5-MT臨界濃度的確定Table 1 Critical concentration of 5-MT resistance

由表1可知色氨酸生產菌對5-MT的臨界質量濃度為1 mg/mL。按照1.2.4的方法對色氨酸生產菌進行誘變處理,從誘變處理后涂布的平板上挑出生長良好的菌落,制成菌懸液分別涂布到含有1、1.5、2 mg/mL 5-MT的平板上,36 ℃培養3 d。從平板上挑選生長良好的菌落115株,分別轉接斜面,命名為ACT001～ACT115。按照1.2.6和1.2.7的方法對得到的突變株進行篩選,篩選出色氨酸產量較高的5株菌株,結果如表2。

表2 突變株篩選結果Table 2 Results of the mutant strain screening

將表2中的5株菌株進行遺傳穩定性實驗,轉接斜面傳至第10代,取第10代菌株做搖瓶發酵產酸驗證,與初代突變株產酸結果進行對照,試驗結果見圖2。經過傳代試驗,菌株ACT106產酸最高,并且能夠穩定產酸,選擇菌株ACT106做下一步誘變處理出發菌。

圖2 遺傳穩定性測定Fig.2 Determination of genetic stability

2.3 PFP抗性菌株的篩選

在色氨酸的生物合成途徑中,3-脫氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(3-deoxy-2-arabina-heptanose-7-phosphate,DAHP)反應是第1個限速步驟,DAHP合成酶受L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的協同反饋抑制,第1個分支點處的分支酸變位酶受L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的部分抑制[19]。因此,選育L-苯丙氨酸、L-酪氨酸結構類似物抗性的突變株可以從遺傳上減弱或解除這些反饋抑制作用,增強色氨酸合成途徑的代謝流,提高色氨酸的產出[20]。以菌株ACT106為出發菌株,經ARTP誘變處理后,選育具有PFP抗性的突變菌株。首先確定色氨酸生產菌株對PFP耐受的臨界質量濃度為0.5 mg/mL。按照方法1.2.4對菌株ACT106進行誘變處理,從誘變處理后涂布的平板上挑出生長良好的菌落,制成菌懸液分別涂布到含有0.5、1、1.5 mg/mL PFP的平板上,36 ℃培養3 d。最終從平板上篩選到生長良好的菌落109株,分別轉接斜面,命名為ACTR001～ACTR109。按照1.2.6和1.2.7的方法對得到的突變株進行篩選,選出產量較高的5株菌株,搖瓶復篩后各菌株的產酸結果如表3所示。

表3 突變株篩選結果Table 3 Results of the mutant strain screening

將表3中的5株菌株進行傳代,考察菌株的遺傳穩定性,傳至第10代時,取第10代菌株做搖瓶發酵產酸驗證,與初代突變株產酸進行對照,結果見圖3。經過傳代試驗,菌株ACTR103產酸最高,并且能夠穩定產酸,選擇菌株ACTR103做下一步誘變處理出發菌。

圖3 遺傳穩定性測定Fig.3 Determination of genetic stability

2.4 多次ARTP誘變處理+抗性篩選

將上述誘變篩選出菌株ACTR103按照1.2.4和1.2.5進行多次誘變處理和抗性篩選,使菌株對5-MT和PFP的抗性分別提高至5和3 mg/mL。經過篩選,選出產量較高的5株菌株,結果如表4。將表4中的5株菌株進行傳代考察菌株的遺傳穩定性,傳至第10代時,取第10代菌株做搖瓶發酵產酸驗證,與初代突變株產酸進行對照,結果見圖4。經過傳代復篩后上述5株菌株均能穩定產酸,其中菌株ACTRP104搖瓶發酵后的L-色氨酸質量濃度為4.591 g/L,比原始菌株AC-1042搖瓶發酵后的L-色氨酸質量濃度(3.570 g/L)提高了28.6%。

表4 突變株篩選結果Table 4 Results of the mutant strain screening

圖4 遺傳穩定性測定Fig.4 Determination of genetic stability

2.5 30 L發酵罐培養驗證

為考察突變株ACTRP104發酵生產色氨酸的性能,使用30 L發酵罐按照1.2.8的方法進行發酵罐培養實驗,同時以菌株AC-1042做對照。結果如圖5所示。

a-突變株ACTRP104；b-出發菌AC-1042圖5 突變株ACTRP104與出發菌AC-1042發酵過程比較Fig.5 Comparision of fermentation process between mutant ACTRP104 and AC-1042

在發酵過程中,突變株ACTRP104菌體增長的OD600值和殘糖濃度相比出發菌AC-1042差別不大,但是色氨酸濃度從8 h后突變株ACTRP104明顯高于出發菌AC-1042。從30 L罐發酵的結果來看,出發菌AC-1042發酵結束時,色氨酸質量濃度為51.08 g/L,而突變株ACTRP104發酵結束時,色氨酸質量濃度達到61.65 g/L,相比出發菌AC-1042提高了20.69%。經過計算,突變株ACTRP104發酵結束葡萄糖轉化率達到20.64%,比出發菌AC-1042的葡萄糖轉化率(17.52%)提高了17.81%；同時,突變株ACTRP104的發酵周期也比出發菌AC-1042縮短了4 h。

3 結論與討論

本研究通過使用ARTP誘變育種技術結合結構類似物抗性定向篩選技術,進行高產色氨酸菌株的選育。結果表明,經過ARTP誘變處理后更易于在結構類似物抗性的篩選平板上獲得抗性突變株。ARTP誘變育種技術與結構類似物抗性定向篩選相結合的策略,可以高效地選育色氨酸高產菌株。ARTP誘變處理色氨酸生產菌株的處理時間選擇40 s,致死率達到90%以上,使用分別含有5-MT、PFP的抗性培養基進行抗性篩選,篩選解除或減弱L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸反饋抑制的突變株。經過多次ARTP處理和抗性篩選,并經過遺傳穩定性測定,最終獲得1株高產色氨酸的突變株ACTRP104,經過30 L發酵罐培養,色氨酸質量濃度達到61.65 g/L,對葡萄糖的轉化率達到20.64%,相比于出發菌AC-1042分別提高了20.69%和17.81%,同時發酵周期縮短了4 h。研究結果證明,本研究采用的ARTP誘變育種技術與結構類似物抗性定向篩選相結合的策略選育色氨酸高產菌株取得了良好的效果,可以進一步持續對色氨酸生產菌進行選育改良。色氨酸突變株ACTRP104發酵技術水平有了較大提升,菌種穩定性良好,應用于色氨酸工業化生產,可以顯著提高色氨酸發酵的產酸率和轉化率,降低發酵生產成本,具有較好的工業化推廣與應用潛力。