A152G突變對(duì)GH43家族麥?zhǔn)辖惶鎲伟揪厶敲竂ynZT-2的影響

徐佳,高廷,楊彥博,劉永輝,田艷杰,崔彩霞,郭長(zhǎng)江*,周晨妍*

1(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng),453003) 2(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 三全學(xué)院,河南 新鄉(xiāng),453003)

木聚糖是植物半纖維素的主要成分,是一種僅次于纖維素的可再生資源[1]。木聚糖酶是一類(lèi)包括β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶的酶系[2],廣泛存在于自然界的細(xì)菌[3]、真菌[4]、動(dòng)植物等多種生物中[5]。β-木糖苷酶是木聚糖酶的一種[6],根據(jù)氨基酸的序列相似性,含有此酶活性的糖苷水解酶家族包括GH5、GH43等[7]。由于海洋特殊的環(huán)境,海洋微生物有較獨(dú)特的代謝系統(tǒng),是新物種、基因、藥物及生物材料的主要來(lái)源[8]。近年來(lái),對(duì)海洋來(lái)源的木聚糖酶的研究日益增多[9]。

來(lái)自GH43家族的麥?zhǔn)辖惶鎲伟潜緦?shí)驗(yàn)室從山東煙臺(tái)近海分離的細(xì)菌,無(wú)毒副作用,對(duì)環(huán)境無(wú)污染,除氮效果好,可作為去除水產(chǎn)養(yǎng)殖中無(wú)機(jī)氮的理想菌株[10]。本實(shí)驗(yàn)室從該菌基因組中分離到木聚糖酶基因xynZT-2(GenBank登陸號(hào)：MT814836),前期研究發(fā)現(xiàn)它屬于GH43家族成員。目前,對(duì)于木聚糖酶的分子改造主要有酶活性、熱穩(wěn)定性[11]、底物特異性[12]等方面,且研究多集中于GH10、GH11家族,對(duì)GH43家族的分子改造研究較少。為探索保守位點(diǎn)區(qū)域的突變對(duì)木聚糖酶功能的影響,本研究對(duì)GH43家族木聚糖酶XynZT-2保守位點(diǎn)區(qū)域的第152個(gè)氨基酸位點(diǎn)丙氨酸進(jìn)行分子改造,在獲得突變基因xynZT-2A152G后,將其在大腸桿菌中異源表達(dá),研究重組突變酶與原酶的酶學(xué)性質(zhì)差異,為該酶結(jié)構(gòu)研究做出理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麥?zhǔn)辖惶鎲伟⒋竽c桿菌 BL21(DE3)、質(zhì)粒pET28a,本實(shí)驗(yàn)室保存；DL2000 DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶及IPTG,TaKaRa 公司；DNA 質(zhì)粒小量抽提試劑盒、卡那霉素(Kan)、DNA膠回收試劑盒,上海生工生物工程有限公司；樺木木聚糖,Sigma 公司；其余生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增儀,美國(guó) Bio-Rad公司；其余均為國(guó)產(chǎn)儀器。

1.2 同源序列比對(duì)以及同源建模

在GenBank中通過(guò)BLAST查詢xynZT-2的同源基因序列,序列的同源性比較及核苷酸序列分析利用DNAMAN9.0軟件處理。翻譯為氨基酸序列后,在NCBI上,通過(guò)blastp查詢麥?zhǔn)辖惶鎲伟被嵯嗨菩蛄?MEGA軟件進(jìn)行序列比對(duì)。酶的三維結(jié)構(gòu)采用Swiss-model同源建模。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)麥?zhǔn)辖惶鎲伟蚪M及載體pET-28a的多克隆位點(diǎn),設(shè)計(jì)引物:

A152G-F：5′CCGGGCGTTTTCGAAGACGAT 3′；

A152G-R：5′AACGCCCGGATCGATGCTGTA 3′；

ZT-2-F：5′GGAAGAATTCATGCCGGAGAAACAGT 3′(EcoRⅠ酶切位點(diǎn))；

ZT-2-R：5′CCCAAGAAGCTT TTATTCAACGCGGAC 3′(Hind Ⅲ 酶切位點(diǎn))

送至金唯智生物公司合成。

1.4 突變基因的獲得

采用重疊延伸PCR法,從麥?zhǔn)辖惶鎲伟蚪M上獲得木聚糖酶基因xynZT-2,以xynZT-2為模板,引物ZT-2-F、A152G-R、A152G-F、ZT-2-R各0.5 μL,dNTP 2 μL,ddH2O 16.5 μL,高保真Taq酶0.5 μL,分別獲得上下段。再以含突變點(diǎn)的上下段為模板,突變點(diǎn)ZT-2-F、ZT-2-R為引物,其他條件不變,獲得突變后的基因序列xynZT-2A152G,構(gòu)建pET-28a-xynZT-2,pET-28a-xynZT-2A152G,瓊脂糖凝膠電泳后,割膠回收。

1.5 重組工程菌的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切xynZT-2、突變基因xynZT-2A152G和空質(zhì)粒pET-28a,反應(yīng)條件37 ℃、2.5 h,對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。T4 DNA連接酶連接雙酶切產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),涂布至含Kan抗性的 LB 固體培養(yǎng)基上,經(jīng)檢測(cè)驗(yàn)證后的陽(yáng)性菌落,即為成功構(gòu)建的重組大腸桿菌BL21/xynZT-2及BL21/xynZT-2A152G。

1.6 重組目的基因的表達(dá)

將重組大腸桿菌目的菌株過(guò)夜培養(yǎng)(pET-28a轉(zhuǎn)化菌株作為對(duì)照菌株,同步培養(yǎng)),取1 mL 菌液接種于含Kan的100 mL LB 液體培養(yǎng)基中,放入37 ℃培養(yǎng)箱,220 r/min 培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí),加 IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo),24 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h后,離心得到菌體。將沉淀用5 mL Na2HPO4-NaH2PO4(pH 6.0) 緩沖液懸浮,超聲波破碎,離心得到的上清液為粗酶液。

1.7 重組酶的純化

對(duì)含His標(biāo)簽的原酶及突變酶,采用鎳金屬螯合的親和層析柱純化,收集洗脫過(guò)的樣品液,即為原酶XynZT-2和突變酶XynZT-2A152G,運(yùn)用SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)[13]。

1.8 重組木聚糖酶活力測(cè)定

運(yùn)用DNS法[14]。1 mL酶液與1.5 mL的樺木木聚糖底物(體積分?jǐn)?shù)為0.5%),在50 ℃反應(yīng)15 min,1 min得到1 μmol還原糖需要的酶量即為1個(gè)酶活力單位。

1.9 重組酶酶學(xué)性質(zhì)分析

分別在溫度為35～60 ℃、pH 3.0～9.0處,測(cè)定突變酶XynZT-2-A152G與原酶XynZT-2最適溫度、溫度穩(wěn)定性[15]、最適pH及pH穩(wěn)定性[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶同源序列比對(duì)及突變位點(diǎn)的選擇

GH43家族木聚糖酶基因編碼的蛋白質(zhì)有5組β-折疊片層,5組β-折疊片層圍繞著中心軸腔,形成典型的圓桶形結(jié)構(gòu)[17]。選取blastp上查詢的與麥?zhǔn)辖惶鎲伟鶪H43家族木聚糖酶相似性>75%的同源蛋白序列,序列比對(duì)后,對(duì)第3組折疊片處的活性中心序列進(jìn)行分析(表1),發(fā)現(xiàn)活性中心關(guān)鍵氨基酸天冬氨酸(D)和脯氨酸(P)后保守區(qū)域位點(diǎn)存在丙氨酸(A)和甘氨酸(G) 2種氨基酸。序列分析顯示,在GH43家族相關(guān)物種中,保守位點(diǎn)區(qū)域?qū)?yīng)氨基酸多數(shù)為Ala,僅有Luteimonassp.LNNU 24178突變?yōu)镚ly。本研究選擇麥?zhǔn)辖惶鎲伟揪厶敲竂ynZT-2第3組β折疊片層上第152位氨基酸Ala進(jìn)行改造,突變?yōu)镚ly(圖1)。

表1 木聚糖酶XynZT-2的同源序列比對(duì)Table 1 Homologous sequence comparison of xylanase XynZT-2

2.2 重組工程菌的構(gòu)建

從基因組上獲得木聚糖酶基因xynZT-2(圖2),以xynZT-2為模板,運(yùn)用重疊延伸PCR法[18],得到突變基因上下段(圖3-a、圖3-b)及突變基因xynZT-2A152G(圖3-c),突變基因經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化后,獲得麥?zhǔn)辖惶鎲伟亟M工程菌BL21/xynZT-2及BL21/xynZT-2A152G。

藍(lán)色-a-螺旋；紫色-β-折疊；粉色-無(wú)規(guī)卷曲； 綠色-突變的氨基酸位點(diǎn)(紅色箭頭處) a-XynZT-2的三維結(jié)構(gòu)；b-XynZT-2A152G的三維結(jié)構(gòu)圖1 XynZT-2和XynZT-2A152G三維結(jié)構(gòu)Fig.1 3D structure of XynZT-2 and XynZT-2A152G

M-marker；1-基因 xynZT-2圖2 基因xynZT-2Fig.2 The xynZT-2 gene

M-marker a-突變基因上段;b-突變基因下段;c-突變基因xynZT-2A152G圖3 突變基因片段Fig.3 The fragment of the mutant gene

2.3 重組工程菌基因的驗(yàn)證

2.3.1 雙酶切驗(yàn)證

雙酶切驗(yàn)證從工程菌中提取的重組質(zhì)粒如圖4所示。結(jié)果顯示,原酶與突變酶重組質(zhì)粒pET8a-xynZT-2、pET8a-xynZT-2A152G雙酶切后,在5 369和1 029 bp處均有2條目的條帶,測(cè)序驗(yàn)證顯示,與預(yù)期序列一致,表明重組工程菌得以成功構(gòu)建。

M-marker;1-質(zhì)粒pET8a-xynZT-2雙酶切結(jié)果; 2-質(zhì)粒pET8a-xynZT-2A152G雙酶切結(jié)果圖4 雙酶切驗(yàn)證Fig.4 Identified by restriction enzyme digestion

2.3.2 突變體與原始酶的表達(dá)與純化

為了驗(yàn)證突變體與原酶是否表達(dá)木聚糖酶,進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳和酶活力測(cè)定。如圖5所示,在 38.9 kDa 處,對(duì)照菌株無(wú)條帶,純化后的突變酶與原酶、突變酶粗酶液有相同且明顯的目的條帶,重組酶得以成功表達(dá)。重組突變菌BL21/xynZT-2A152G與重組菌BL21/xynZT-2均有酶活性(pH 6)(圖6),提示重組菌能夠產(chǎn)木聚糖酶,且突變位點(diǎn)不會(huì)抑制酶活力的產(chǎn)生。

M-marker；1-DE3-pET28a粗酶液；2-BL21/xynZT-2粗酶液； 3-BL21/xynZT-2A152G粗酶液；4-純化的BL21/xynZT-2A152G圖5 SDS-PAGE 凝膠電泳檢測(cè)Fig.5 SDS-PAGE gel electrophoresis

圖6 重組菌的酶活力Fig.6 Enzyme activity of the recombinant bacterias

2.4 酶學(xué)性質(zhì)比較

2.4.1 最適溫度

如圖7所示,原酶XynZT-2最適溫度45 ℃,突變酶XynZT-2A152G最適溫度55 ℃。突變酶XynZT-2A152G比原酶XynZT-2有明顯提高。說(shuō)明保守位點(diǎn)附近的第152位氨基酸Ala突變?yōu)镚ly,此突變使木聚糖酶最適溫度得到提高。

圖7 突變酶與原酶的最適溫度Fig.7 Optimal temperatures of original xylananse and mutant

2.4.2 最適pH

原酶最適pH為6.0,突變酶最適pH為7.0,二者差別不大(圖8)。在pH 3.0～5.0處,突變酶相對(duì)酶活力<30%；在pH 7.0～9.0處,突變酶相對(duì)酶活力>80%,高于原酶,說(shuō)明突變酶適宜偏堿性環(huán)境。

圖8 突變酶與原酶的最適pHFig.8 Optimum pH of original xylananse and mutant

2.4.3 pH穩(wěn)定性

突變酶在pH 3.0～7.0相對(duì)酶活力與原酶相差不大,在 pH 8.0～9.0酶活力均高于80%(圖9),突變酶在堿性條件下比原酶穩(wěn)定性更強(qiáng)。

圖9 pH穩(wěn)定性Fig.9 pH stability of original xylananse and mutant

2.4.4 溫度穩(wěn)定性

在55和60 ℃,突變酶保溫20 min以內(nèi),二者相對(duì)酶活力均有少許降低；保溫20～60 min,突變酶相對(duì)酶活力均在80%以上,高于相對(duì)酶活力在70%以上的原酶(圖10),說(shuō)明突變酶在高溫環(huán)境中,熱穩(wěn)定性較高。

圖10 原酶和突變酶的溫度穩(wěn)定性Fig.10 Temperature stability of original xylananse and mutant

3 討論與結(jié)論

木聚糖在醫(yī)療衛(wèi)生、食品化工等領(lǐng)域中有巨大應(yīng)用潛力。低聚木糖是2～6個(gè)聚合度的木聚糖,不僅能在大腸內(nèi)顯著增加有益菌,改善腸道微環(huán)境,還能降低結(jié)直腸癌發(fā)病率[19]。木聚糖酶能催化β-1-4糖苷鍵水解,是生成低聚木糖的一種重要酶。工業(yè)生產(chǎn)需要較高熱穩(wěn)定性的木聚糖酶。自然界存在較少的產(chǎn)耐熱木聚糖酶微生物,通過(guò)人工定點(diǎn)突變分子改造提高木聚糖酶熱穩(wěn)定性更為可行[20]。

通過(guò)分子改造木聚糖酶,在熱穩(wěn)定性方面已經(jīng)取得顯著成果。對(duì)木聚糖酶 Xyn A 第209位氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變,His突變?yōu)?Asn后,木聚糖酶熱穩(wěn)定性得到提升[21]。木聚糖酶Umxyn10A 的第31位氨基酸Ala替換為Phe后,熱穩(wěn)定性也得到顯著提高[20]。GH43家族來(lái)源的木聚糖酶的3個(gè)與催化相關(guān)的殘基及酶的中心Ca2+和組氨酸殘基對(duì)酶活性的影響比較重要[22]。目前對(duì)GH43家族木聚糖酶分子改造的報(bào)道較少,本研究利用軟件計(jì)算、隨機(jī)突變及天然存在的突變對(duì)GH43家族麥?zhǔn)辖惶鎲伟M(jìn)行保守位點(diǎn)區(qū)域天然突變位點(diǎn)的引入,希望得到更適合工業(yè)生產(chǎn)的酶。分子改造后,突變酶比原酶在最適溫度方面得以提高；55和60 ℃保溫20～60 min,突變酶相對(duì)酶活力均在80%以上,丙氨酸突變?yōu)楦拾彼岷?能使蛋白質(zhì)更穩(wěn)定[23],熱穩(wěn)定性也得到提高。在最適pH方面,pH為7.0～9.0時(shí),突變酶相對(duì)酶活力為80%以上,而原酶相對(duì)酶活力在80%以上的pH為5.0～7.0,相比原酶適合中性及偏酸環(huán)境,突變酶則適宜中性及偏堿性環(huán)境；在 pH 8.0～9.0處,突變酶保溫1 h后,相對(duì)酶活力仍高于80%,原酶則低于65%,表明在堿性條件下,突變酶比原酶pH穩(wěn)定性更強(qiáng)。

本研究在已有GH43家族麥?zhǔn)辖惶鎲伟揪厶敲富騲ynZT-2的基礎(chǔ)上,通過(guò)序列分析和結(jié)構(gòu)建模,對(duì)第152個(gè)氨基酸位點(diǎn)的丙氨酸進(jìn)行同源位點(diǎn)替換,研究發(fā)現(xiàn)木聚糖突變酶XynZT-2A152G最適溫度比原酶XynZT-2 提高了10 ℃；在酸堿度方面,木聚糖突變酶XynZT-2A152G在pH 8.0～9.0 較原酶更穩(wěn)定,說(shuō)明麥?zhǔn)辖惶鎲伟揪厶敲竂ynZT-2保守位點(diǎn)區(qū)域第3組β折疊片層上第152位氨基酸對(duì)酶結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性有重要的影響。